Transwell 细胞迁移与侵袭实验：从原理到操作的详细指南

在肿瘤转移机制研究、药物筛选及细胞生物学功能验证中，Transwell 实验是评估细胞迁移与侵袭能力的经典体外模型。其核心原理是通过模拟体内细胞在趋化因子梯度下的跨膜运动，量化细胞的迁移或侵袭潜能。本文将系统梳理 Transwell 迁移与侵袭实验的操作细节、关键优化技巧及结果分析方法，助力研究者规范实验流程并提高数据可靠性。

一、实验核心原理与区别

Transwell 实验主要分为迁移实验和侵袭实验，二者核心装置一致，但通过是否添加人工基底膜模拟体内微环境差异：

核心装置结构：Transwell 小室由上腔室（含多孔滤膜，孔径常用 8μm）和下腔室（24 孔板孔）组成。细胞接种于上腔室，下腔室添加趋化因子溶液，细胞受趋化信号驱动穿过滤膜（或先穿透 Matrigel 再穿膜），最终通过计数穿膜细胞量化能力强弱。

二、详细操作步骤

2.1 实验前准备：Matrigel 包被（侵袭实验专属）

Matrigel 是模拟体内细胞外基质（ECM）的关键试剂，其状态对实验结果影响显著，操作需严格控温：

• 冰上操作：Matrigel 在 4℃为液态，室温或 37℃快速凝固，取出后需全程置于冰盒，避免提前凝固。
• 浓度稀释：用预冷的无血清培养基稀释至 25-100μg/mL（浓度需根据细胞类型预实验确定：如结直肠癌细胞常用 50-75μg/mL，乳腺癌细胞可适当调整）。
• 均匀铺胶：轻柔滴加 50-100μL 稀释后的 Matrigel 至滤膜上表面，严禁产生气泡（气泡会导致局部无基质覆盖，影响实验真实性）。立即放入 37℃培养箱孵育 1-3 小时，待其完全凝固为胶状。

注：Matrigel 主要成分为层粘连蛋白、胶原蛋白 IV 及多种生长因子，凝固后形成三维结构，可模拟体内基底膜屏障。

2.2 上层细胞悬液制备

细胞悬液的状态直接影响迁移 / 侵袭动力，需严格去除干扰因素：

1. 消化与终止：用 0.25% 胰酶消化对数期细胞，待细胞变圆、间隙增大后，立即加入含血清培养基终止消化，收集细胞悬液。
2. 洗涤去干扰：1000rpm 离心 3 分钟，弃上清；用 PBS 轻柔重悬细胞洗涤 1 次（彻底去除残留血清和胰酶，避免血清中的生长因子干扰下腔室趋化信号），再次离心弃上清。
3. 无血清重悬：用无血清培养基重悬细胞，计数后调整密度至 1×10⁵ cells/mL 左右（具体密度需预实验优化：如 A549 肺癌细胞迁移实验常用此密度，而侵袭实验可适当提高）。
4. 关键逻辑：无血清环境可增强细胞对下腔室趋化因子的 “趋化动力”，提高实验灵敏度。

2.3 趋化系统组装与培养

上下腔室的组装需确保趋化梯度稳定，避免气泡干扰：

• 下腔室加趋化因子：24 孔板下腔室加入 500μL 趋化培养基：
  • 通用方案：含 10% FBS 的完全培养基（血清中的生长因子为强趋化信号，适用于大多数细胞的基础迁移 / 侵袭能力评估）；
  • 特异性方案：如研究乳腺癌向骨髓转移，可加入含 50-100ng/mL SDF-1α 的无血清培养基，精准检测细胞对特定因子的响应。
• 放置 Transwell 小室：用无菌镊子将小室轻放入下腔室，确保小室底部与下层液体充分接触，膜下方无气泡（气泡会阻断细胞穿膜路径，导致结果偏差）。
• 接种细胞：向上腔室轻柔加入 200μL 细胞悬液（约 2×10⁴个细胞），侵袭实验需注意避免戳破 Matrigel 胶层。
• 培养时间控制：37℃、5% CO₂培养箱孵育 12-48 小时（迁移实验时间短于侵袭实验：如 A549 肺癌细胞迁移 12 小时为宜，侵袭实验需延长 6-12 小时）。

2.4 实验终止与染色

终止实验的核心是准确保留穿膜细胞，去除未迁移细胞：

1. 擦除未迁移细胞：用湿润的无菌棉签轻擦上腔室滤膜表面（力度适中，避免擦破滤膜或蹭掉已穿膜细胞），确保仅保留滤膜下表面的穿膜细胞。
2. 固定细胞：新 24 孔板孔中加入 600μL 4% 多聚甲醛，将小室膜面朝下放于孔中，确保膜完全浸没，室温固定 30 分钟。
3. 染色：转移小室至含 0.1% 结晶紫染液的孔中，膜面浸入染液，室温避光染色 20 分钟；PBS 洗涤 2-3 次去除多余染液，吸干小室底面水分。

2.5 结果分析与统计

1. 镜检计数：倒置显微镜下观察滤膜下表面的紫色染色细胞，随机选取 5 个不重叠视野（如中央、上下左右各 1 个），100 或 200 倍镜下计数每个视野的细胞数。
2. 统计分析：计算 5 个视野的细胞平均数，通过组间比较（如实验组 vs 对照组）评估迁移 / 侵袭能力差异。采用 T 检验或方差分析（ANOVA）进行统计学检验，p<0.05 为差异具有统计学意义。

三、关键优化技巧

1. Matrigel 浓度优化：不同细胞侵袭能力差异大，需通过预实验确定最佳浓度（如高侵袭性细胞可提高浓度至 100μg/mL，低侵袭性细胞降低至 25μg/mL）。
2. 细胞密度调整：密度过高易导致细胞堆叠穿膜，密度过低则计数误差大，建议通过预实验筛选 “穿膜细胞数适中（50-200 个 / 视野）” 的密度。
3. 趋化因子浓度验证：特异性趋化因子（如 SDF-1α、EGF）需优化浓度，避免过高导致信号饱和或过低无趋化效应。
4. 时间节点控制：根据细胞类型预设多个时间点（如 12h、24h、36h），选择 “穿膜细胞数随时间递增且未达到平台期” 的时间点作为实验终点。

四、常见问题与解决方案

五、总结

Transwell 实验的核心在于通过标准化操作模拟体内细胞迁移 / 侵袭的微环境，其结果可靠性依赖于 Matrigel 包被、细胞状态控制、趋化系统构建及染色计数等关键步骤的精准执行。通过预实验优化参数（浓度、密度、时间）并严格控制操作细节，可有效提高实验重复性和数据可信度，为细胞迁移与侵袭相关研究提供可靠的量化依据。