水稻调控组全景的综合绘制与建模揭示了复杂性状背后的调控架构
摘要：
解析调控复杂性状的分子机制是推动作物改良的关键。本研究构建了水稻（Oryza sativa）迄今最全面的调控组图谱，系统描绘了3个代表性品种23种不同组织的染色质可及性景观。我们鉴定出117,176个独特的开放染色质区域（OCRs），占水稻基因组的约15%，该比例显著高于以往植物领域的报道。通过整合配对组织的RNA-seq数据，我们高置信度预测了59,075个OCR-基因调控关联，其中69.54%由增强子介导，并涵盖多个已知的增强子-基因互作案例。
基于该资源，我们重新评估了全基因组关联研究（GWAS）结果，发现转录因子OsbZIP06在种子萌发中的未知功能，并通过实验予以证实。我们优化深度学习模型以解析调控序列语法，实现了组织特异性染色质可及性的稳健建模。该方法可仅依据基因组序列预测品种间调控动态差异，为阐释顺式调控变异与品种形态分化的遗传基础提供了新视角。
综上，本研究为水稻功能基因组学与精准分子育种奠定了重要基础，并为解析复杂性状的调控机制提供了宝贵资源。
水稻（Oryza sativa）不仅是全球最重要的粮食作物之一，也是研究植物生长发育的卓越模式物种。过去二十年来，科研界投入巨大努力，以解析水稻重要农艺性状的遗传基础。其中，全基因组关联分析（GWAS）在这一进程中发挥了关键作用，成功将遗传变异与表型多样性联系起来。这些研究鉴定出大量有望用于性状改良的候选基因。然而，尽管取得了上述进展，我们对调控水稻复杂性状的分子机制仍缺乏完整认识。
基因调控网络（GRNs）在很大程度上由顺式调控 DNA 序列（如启动子和增强子）决定，这些序列可被特定的转录因子（TFs）识别并结合。解析这些调控序列内在的“调控密码”，并将调控序列与其靶基因准确关联，是重编程 GRNs、实现作物改良与性状优化的关键。然而，在水稻中，对“调控组”（regulome，即全基因组范围内所有调控元件的集合）的系统性刻画仍十分有限。现有研究往往聚焦于单一或少数组织，忽视了发育阶段和组织类型的全景式覆盖。同样，将调控区域与其靶基因建立可靠连接的努力亦显不足。
与此同时，许多与水稻农艺性状相关的功能遗传变异位于非编码调控区（例如 qSH1、DROT1 和 FZP），这使得它们的生物学解释极具挑战性，也凸显了对调控序列进行系统性解析的迫切需求。鉴于不同性状在特定发育阶段和组织中才显现出来，目前尚缺乏涵盖多种组织与生长时期的综合表观基因组图谱，这极大阻碍了水稻非编码调控变异的系统注释工作。
为弥合上述研究空白，我们采用实验室自主改良的 UMI-ATAC-seq 技术（一种优化的 ATAC-seq 方法），系统绘制了 3 个代表性水稻品种全生命周期多种组织的染色质可及性图谱。通过对 145 份 ATAC-seq 数据的整合分析，共鉴定出 117,176 个独特的开放染色质区域（OCRs），约占水稻基因组的 15%。结合配对组织的 RNA-seq 数据，我们基于跨组织的基因表达与邻近染色质可及性的相关性，预测了各 OCR 的潜在靶基因。
借助转录因子足迹（TF footprinting）分析，我们推断了组织或发育阶段特异性的调控网络；并通过比较籼稻与粳稻亚种的调控景观，鉴定出品种间多态/性状关联的 OCR。尤为重要的是，我们发现 GWAS 关联变异显著富集于组织特异性 OCR 中，依托这一 OCR 图谱，成功将 209 个复杂性状与非编码调控变异建立了因果关联。
进一步地，我们利用优化的深度学习模型，通过建模组织特异性染色质可及性并基于序列进行跨品种预测，解码了调控“语法”，揭示了导致顺式调控分化的关键遗传变异。综上，这些数据不仅成为植物研究领域的基石资源，也为精准分子育种提供了宝贵的调控变异位点。
结果
绘制水稻染色质可及性参考图谱
为了全面描绘水稻（Oryza sativa）开放染色质的景观，我们采用改进的 ATAC-seq 方法——UMI-ATAC-seq（在常规 ATAC-seq 基础上引入唯一分子标签，实现精确定量与足迹分析），对覆盖水稻整个生命周期的 23 种组织/器官进行染色质可及性分析。代表性组织包括：愈伤组织、胚根、胚芽、叶片、叶鞘、根、顶端分生组织（AM1/AM2）、休眠芽（DBuds）、茎端分生组织（SAM1/SAM2/SAM3）、穗颈节（PNN）、茎、幼穗（Panicle1–Panicle4）、外稃、内稃、雌蕊、雄蕊及种皮（Seed1–Seed3）。实验在 3 个代表性品种中开展：日本晴（NIP，粳稻亚种）、明恢 63（MH63，籼稻 II 型）和珍汕 97（ZS97，籼稻 I 型），每样本均设至少 2 次生物学重复（图 1a 与补充数据 1）。
总计获得 145 个高质量全基因组染色质可及性数据集，平均测序深度约 30.7 M reads。我们遵循 ENCODE 标准 13,14 搭建分析流程（见方法）。与 ChIP-Hub 数据库 14 中已发表的植物 ATAC-seq 数据相比，本研究数据信噪比显著提高（补充图 1）。利用三个品种各自参考基因组 15,16 进行分析，平均每实验鉴定 40,676 个（28,991–49,737 个）可重复 OCR（不可重复发现率 IDR 17 < 0.05）（图 1b）。
正如预期，所有实验检出的 OCR 主要集中于转录起始位点（TSS）近端上游区域或远端基因间区（图 1b, f；补充图 2；补充数据 2），分别对应启动子或增强子特征 18。值得注意的是，基因内部 OCR 占比较低（约 15.7%），且大多来源于内含子区域（补充图 2b）。这些结果表明，水稻基因组中的 OCR 绝大部分源自非编码序列。
我们估计，大约 15% 的水稻基因组可被注释为开放染色质区域（OCR），且这一比例在三个品种中高度一致（图 1c）；饱和度分析显示，该估计已趋于饱和（图 1d）。OCR 富含多种转录因子（TF）结合位点，并负责调控其靶基因的表达。我们收集了 56 种 TF 的公开 ChIP-seq 数据（补充数据 3），并结合 ChIP-Hub 数据库 14 中预测的 458 种水稻 TF DNA 基序，结果显示 OCR 显著富集 TF 结合位点（图 1e）。此外，与侧翼基因组区域相比，OCR 表现出更高的进化约束（图 1g），支持了先前关于保守非编码序列（CNSs）可预测植物 OCR 的发现。
随后，我们从同一参考基因组（日本晴）合并全部 OCR（n = 117,176），对所有数据集进行量化，并利用 t-SNE 降维可视化其整体模式。结果中，t-SNE 的第 1、2 维主要反映籼稻（MH63 和 ZS97）与粳稻（NIP）亚种间的差异，而第 2、3 维则清晰区分不同组织类型（图 1h）。例如，日本晴的营养组织与生殖组织在染色质可及性上各自聚类；而幼穗与愈伤组织无论品种来源如何，均呈现相似的模式。我们进一步基于 Jensen-Shannon 散度（JSD）计算每个 OCR 的组织特异性，发现远端 OCR 的特异性得分显著高于近端 OCR（图 1i 及补充图 3a,b），与先前报道一致。
综上，本研究构建的水稻全景式开放染色质图谱，为作物功能基因组学研究提供了宝贵资源。
将开放染色质区域（OCR）与靶基因关联
为解析这些 OCR 可能调控的基因，我们为每个品种的全部受检组织同步测定了相匹配的 RNA-seq 数据（补充图 3c、补充数据 4）。我们采用现有策略 23，以所有样本中 OCR 可及性与基因表达的相关性为基础，预测 OCR–基因调控链接（图 2a；见方法）。基因可借助多个 OCR（包括启动子与增强子）通过染色质互作实现调控，而这些互作通常发生在拓扑关联结构域（TAD）内部。根据水稻 Hi-C 数据 24,25，TAD 大小估计为 35–45 kb，因此我们将搜索范围限定在转录起始位点（TSS）上下游各 20 kb（共 40 kb）以内，以预测 OCR 的潜在靶基因。
以绝对皮尔逊相关系数 |R| ≥ 0.4 且 P < 0.05 为阈值，我们共获得 59,075 条唯一的 OCR–基因链接，涉及 38,437 个 OCR（占全部 OCR 的 32.8%）与 18,781 个基因（占注释基因的 48.1%；补充图 4a,b 与补充数据 5）。正如预期，近端 OCR 的 OCR–基因链接频率显著更高，其基因表达与染色质可及性的相关性也随之增强（补充图 4c–f）。