植物来源细胞外囊泡的脂质组学分析
在当前纳米医学研究领域，细胞外囊泡（EVs）作为天然的生物活性载体，在生物医学多个方向均展现出显著应用潜力，其中哺乳动物来源 EVs 因具备天然治疗活性和递送功能，被视为下一代纳米医学的重要研究对象。然而，这类 EVs 的临床转化进程受限于产量低下、缺乏规模化制备技术等关键问题，使得科研人员开始寻找更具可持续性的替代方案。植物来源细胞外囊泡（PEVs）正是在这一背景下进入研究视野，其研究历史可追溯至 1967 年，当时科学家首次在胡萝卜细胞培养体系中观察到 PEVs 的存在，但直到近二十年，随着分离、表征技术的不断发展，PEVs 的生物学特性及应用价值才逐渐被揭示。
已有研究证实，PEVs 在形态、粒径分布、表面电荷等理化性质上与哺乳动物来源 EVs 高度相似，且富含蛋白质、脂质、代谢物等生物分子，这使得 PEVs 继承了其来源植物的生物活性，具备天然纳米载体的特质。更重要的是，PEVs 来源于可食用或药用植物，在人体应用中具有良好的安全性和生物相容性，因此近年来成为抗炎、抗氧化应激及抗癌相关研究的热点方向。同时，相较于合成纳米颗粒和哺乳动物来源 EVs，PEVs 在免疫原性、不良反应控制、生物稳定性及规模化制备方面均展现出明显优势，理论上更适合作为生物活性物质的递送载体。
尽管 PEVs 的生物医学应用前景广阔，但其临床转化仍面临诸多挑战，核心问题在于 PEVs 研究尚处于起步阶段，相关研究结论存在混淆甚至矛盾。例如，柠檬来源 EVs（LEVs）在部分研究中被证实具有抗氧化、抗炎作用，而另一部分研究则发现 LEVs 可通过调节活性氧（ROS）水平或激活 TRAIL 信号诱导细胞凋亡、抑制肿瘤生长；葡萄柚、生姜、芦荟皮来源 PEVs 均被报道具有抗氧化活性，但现有研究既未对不同 PEVs 的活性进行横向比较，也未针对抗氧化应用场景优化 PEVs 的制备或使用条件。造成这些问题的关键原因在于，目前对 PEVs 的组成，尤其是发挥核心功能的脂质成分缺乏系统解析，同时缺乏可靠的 PEVs 标志物用于分离、分类及质量控制，这些因素严重制约了对 PEVs 生物活性及药理作用的深入理解，也阻碍了 PEVs 应用方向的精准定位。
基于上述研究现状，本研究采用多组学技术对四种常见食用植物（葡萄柚、生姜、柠檬、葡萄）来源的 PEVs 进行系统组成分析，旨在明确其脂质及蛋白质组成特征，为 PEVs 的下游生物医学应用提供指导。研究首先通过差速离心法分离获得四种 PEVs（分别命名为 GFEVs、GEVs、LEVs、GPEVs），并通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）对其形态、粒径分布及表面电位进行表征；随后利用液相色谱 - 质谱（LC-MS）进行脂质组学分析，重点关注不同 PEVs 的脂质组成差异，尤其对 GEVs 中检测到的姜辣素、姜酚类成分进行验证；通过体外细胞实验评估 GEVs 对肿瘤细胞的毒性、增殖抑制及凋亡诱导作用；进一步通过膜插入法将肿瘤靶向肽 iRGD 修饰于 GEVs 表面（制备 GEV-iRGD），验证其靶向性及体内肿瘤富集能力；结合转录组学分析揭示 GEVs 发挥肿瘤抑制作用的分子机制；最后通过蛋白质组学分析筛选 PEVs 的潜在标志物，为 PEVs 的标准化研究提供依据。
在 PEVs 的分离与制备过程中，研究首先选取新鲜葡萄柚、生姜、柠檬、葡萄，经去离子水充分清洗后去皮，取果肉置于榨汁机中，加入 PBS 匀浆获得汁液。随后采用差速离心法分离 PEVs：先将汁液于 1000×g 离心 10 分钟，去除大颗粒杂质；收集上清液，于 3000×g 离心 30 分钟，进一步去除细胞碎片；再次收集上清，于 10000×g 离心 1 小时，去除较大的亚细胞结构；最终将上清液转移至超速离心管，于 100000×g 离心 2 小时，离心后沉淀用 PBS 重悬，经 0.22 μm 滤膜过滤后，置于 - 80℃保存备用，该过程可有效去除非囊泡杂质，确保 PEVs 的纯度。
对 PEVs 的表征实验中，TEM 分析采用 Thermo Fisher Talos L120C 透射电子显微镜，加速电压设定为 120 kV，将 PEVs 样品滴加至铜网后负染，干燥后观察形态，结果显示四种 PEVs 均呈现典型的杯状结构，符合 EVs 的形态特征；NTA 分析使用 Malvern NanoSight NS300 纳米颗粒跟踪分析仪，测定 PEVs 的浓度及粒径分布，每个样品重复测定 3 次，结果以均值 ± 标准差（SD）表示，数据显示 GFEVs、GEVs、LEVs、GPEVs 的粒径峰值分别为 156 nm、197 nm、107 nm、191 nm；DLS 分析采用 Brookhaven Instruments NanoBrook Omni 颗粒分析仪，测定 PEVs 的 zeta 电位，结果显示四种 PEVs 的 zeta 电位分别为 - 24.90±2.88 mV（GFEVs）、-39.61±1.93 mV（GEVs）、-23.57±2.06 mV（LEVs）、-25.25±2.64 mV（GPEVs），这些理化性质数据与已报道的哺乳动物来源 EVs 特征相符，证实了 PEVs 的成功分离。
脂质组学分析是本研究的核心环节之一，首先进行脂质提取：将冷冻保存的 PEVs 样品在冰上解冻，取 20 μL 样品与 240 μL 预冷的脂质提取液（异丙醇：乙腈：水 = 2:1:1，体积比）混合，涡旋振荡 1 分钟至充分混匀；随后在室温下孵育 10 分钟，转移至 - 20℃冰箱过夜，使脂质充分溶解；次日将混合液于 4000×g 离心 20 分钟，收集上清液，置于 - 80℃保存，待 LC-MS 分析。LC-MS 分析采用 Waters Corporation ACQUITY UPLC 系统结合 SCIEX TripleTOF6600 高分辨串联质谱仪，色谱分离选用 Phenomenex Kinetex UPLC C18 柱（100 mm×2.1 mm，100Å），柱温设定为 55℃，流速 1 mL/min；流动相由 A 相（乙腈：水 = 6:4，含 0.1% 甲酸）和 B 相（异丙醇：乙腈 = 9:1，含 0.1% 甲酸）组成，梯度洗脱程序如下：0~0.4 分钟，30% B；0.4~1 分钟，30%~45% B；1~3 分钟，45%~60% B；3.5~5 分钟，60%~75% B；5~7 分钟，75%~90% B；7~8.5 分钟，90%~100% B；8.5~8.6 分钟，100% B；8.6~8.61 分钟，100%~30% B；8.61~10 分钟，30% B。质谱检测采用正负离子模式，参数设置为： curtain gas 30 PSI，离子源气体 1（GS1）60 PSI，离子源气体 2（GS2）60 PSI，接口加热温度 650℃；正离子模式下离子喷雾电压（IS）5000 V，负离子模式下 IS -4500 V；采用信息依赖采集（IDA）模式，质量扫描范围 60~1200 Da，survey 扫描时间 150 ms，当离子信号超过 100 counts/s 且电荷态为 1 + 时，最多采集 12 个产物离子扫描，总循环时间 0.56 s；采用 40 GHz 多通道 TDC 检测器，4 个阳极 / 通道检测，脉冲频率 11 kHz，每扫描累加 4 个时间仓；动态排除时间 4 秒，每 20 个样品进行一次质量校正，同时每 10 个样品插入一个质量控制（QC）样品（由各脂质提取液按 10 μL / 样混合制备），确保检测结果的稳定性和可靠性。
细胞实验部分，研究选用 B16F10 黑色素瘤细胞及表达荧光素酶的 B16F10-Luc 细胞，细胞培养于含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中，置于 37℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养，当细胞密度达到约 90% 时，采用胰蛋白酶消化传代；缺氧培养条件通过通入 94% N₂、5% CO₂、1% O₂的混合气体维持。
细胞毒性评估采用 CCK-8 法和 IVIS 光谱成像技术。CCK-8 实验中，将 B16F10 细胞以 1×10⁴个 / 孔的密度接种于 96 孔板，过夜培养后，加入不同浓度（0、10⁸、10⁹、10¹⁰ EVs/mL）的四种 PEVs，孵育 24 小时；随后每孔加入 10 μL CCK-8 试剂，继续孵育 4 小时，使用 Tecan Infinite E Olex 酶标仪测定 450 nm 处的吸光度（OD 值），计算细胞相对活力。IVIS 光谱成像实验中，B16F10-Luc 细胞以 1×10⁴个 / 孔接种于 96 孔板，过夜培养后加入不同浓度（0、1×10⁹、2.5×10⁹、5×10⁹、7.5×10⁹、10×10⁹ EVs/mL）的 GEVs，孵育 24 小时；随后更换为含有 150 μg/mL AbMole 品牌 D - 荧光素（M8873）的新鲜培养基，通过 PerkinElmer IVIS Spectrum 系统进行成像，并用 Living Image 软件分析荧光信号强度，间接反映细胞活力。
为提升 GEVs 的肿瘤靶向性，研究采用膜插入法制备 GEV-iRGD：将 DSPE-PEG-iRGD溶液按 20000:1 的比例（DSPE-PEG-iRGD:GEVs，摩尔比）加入 GEVs 溶液中，4℃振荡孵育 4 小时；随后使用 10 kDa 超滤离心管，用 PBS 清洗 3 次，去除未结合的 DSPE-PEG-iRGD，获得 GEV-iRGD。对 GEV-iRGD 的表征显示，TEM 图像显示其仍保持典型杯状形态，说明修饰过程未破坏 GEVs 的膜完整性；DLS 分析显示，相较于未修饰 GEVs，GEV-iRGD 的粒径略有增加，而 zeta 电位从 - 38.9 mV 显著变化至 - 16.8 mV，这一变化可能源于 DSPE-PEG-iRGD 分子的引入；为进一步验证修饰成功，将 DSPE-PEG-iRGD-FITC按相同比例与 GEVs 孵育，超滤清洗后通过流式细胞仪分析，结果显示 GEV-iRGD-FITC 的荧光强度显著高于未修饰 GEVs，证实 DSPE-PEG-iRGD 成功插入 GEVs 膜表面。
体内实验选用 4 周龄雌性 C57BL/6J 小鼠（体重约 20 g），肿瘤模型建立：通过皮下注射 1×10⁶个 B16F10 细胞（100 μL PBS 悬浮）至小鼠左侧胁部，7 天后肿瘤体积达到约 60 mm³ 时开始实验。
体内生物分布实验中，将小鼠随机分为两组，分别尾静脉注射 1×10⁹个 Cy5 标记的 GEVs 或 GEV-iRGD（100 μL PBS 悬浮）；在注射后 4 小时、24 小时、72 小时，每组处死 3 只小鼠，收集心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏及肿瘤组织，通过 IVIS Spectrum 系统进行成像，测定各组织的荧光辐射效率；随后将肿瘤和肝脏组织用 4% PFA 固定，30% 蔗糖脱水过夜，OCT 包埋剂包埋后制作冰冻切片，DAPI 染核，CLSM 观察 Cy5 荧光分布，分析 GEVs 和 GEV-iRGD 在体内的组织分布及肿瘤富集能力。
体内肿瘤抑制实验中，将荷瘤小鼠随机分为 3 组（每组 6 只）：对照组（PBS）、GEVs 组（2×10¹⁰个 GEVs/100 μL PBS）、GEV-iRGD 组（2×10¹⁰个 GEV-iRGD/100 μL PBS），每隔 2 天尾静脉注射一次，共注射 3 次。实验期间，每隔 2 天测量肿瘤的长径和短径，按公式 V = 长 × 宽 ²/2 计算肿瘤体积；同时记录小鼠体重变化，评估处理对小鼠整体状态的影响。第 14 天，通过 CO₂窒息法处死小鼠，解剖收集肿瘤及主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏），称重肿瘤组织，用于后续组织学分析。
组织学分析包括 H&E 染色、TUNEL 染色及免疫组化（IHC）。H&E 染色中，肿瘤及器官组织经 4% PFA 固定后，石蜡包埋，制作 5 μm 切片，常规 H&E 染色，通过 Olympus SlideView VS200 研究级切片扫描仪观察组织形态变化。TUNEL 染色中，肿瘤石蜡切片脱蜡至水，4% PFA 固定，按 TUNEL 试剂盒说明书染色，DAPI 染核，CLSM 观察凋亡细胞。IHC 实验中，肿瘤切片脱蜡至水，抗原修复后，5% 脱脂牛奶封闭 1 小时，加入 Ki-67 一抗，4℃孵育过夜；次日加入 HRP 标记二抗，室温孵育 1 小时，DAB 显色，苏木素复染，脱水透明，封片后通过切片扫描仪观察，Ki-67 阳性细胞代表增殖活跃的肿瘤细胞。
血液学及生化分析中，小鼠处死后收集全血，进行血常规检测，分析白细胞、红细胞、血小板等指标；部分血液样本室温静置凝血后，2000×g 离心 20 分钟，收集血清，检测血清中血尿素氮（BUN）、肌酐（CR）、尿酸（UA）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）水平，评估处理对肝肾功能的影响。
转录组学分析旨在揭示 GEVs 抑制肿瘤细胞的分子机制。首先提取经 GEVs（5×10⁹ EVs/mL）处理 24 小时的 B16F10 细胞及对照组细胞的总 RNA（Trizol 试剂，AbMole），经纯度和完整性验证后，进行 cDNA 文库构建及 RNA 测序（RNA-seq）。测序数据采用 R 3.6.3 软件分析，通过主成分分析（PCA）和 Pearson 相关性分析评估样本差异；采用火山图筛选差异表达基因（筛选标准：|log₂FC|>1，调整后 P<0.05）；通过基因本体论（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，明确差异基因参与的生物学过程及信号通路；最后通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）验证关键差异基因的表达，计算基因相对表达量。
蛋白质组学分析用于筛选 PEVs 的潜在标志物。四种 PEVs 经 RIPA 裂解液提取总蛋白，测定蛋白浓度后，进行 4D 无标记定量蛋白质组学分析（HPLC 系统）。通过 PCA 分析样本聚类情况，Venn 图分析四种 PEVs 共有的及特有的蛋白质；将鉴定到的蛋白质与 Vesiclepedia 数据库中哺乳动物来源 EVs 的标志物进行对比，同时分析每种 PEVs 中表达量前 200 的蛋白质，筛选出在四种 PEVs 中均高表达且与哺乳动物 EVs 标志物重叠的蛋白质，作为 PEVs 的潜在标志物。
脂质组学分析结果显示，PCA 分析中四种 PEVs 的脂质样本呈现明显的聚类特征，其中 GFEVs 与 LEVs 的脂质组成相似度最高，这可能与其同属柑橘属植物的进化关系密切；四种 PEVs 中检测到的分子总数分别为 GFEVs 16623 个、GEVs 49139 个、LEVs 23314 个、GPEVs 10832 个，其中可鉴定的脂质种类分别占 5.91%（GFEVs）、2.69%（GEVs）、5.04%（LEVs）、7.35%（GPEVs），提示 GEVs 的脂质组成更为复杂且未知脂质比例较高。 hierarchical 聚类热图显示四种 PEVs 的脂质丰度存在显著差异；脂质类别分析显示，GFEVs 中甘油磷脂占比最高（50.05%），而 GEVs、LEVs、GPEVs 中甘油脂占比最高（分别为 46.23%、53.77%、47.97%），且 GEVs 的甘油磷脂占比（5.25%）显著低于其他 PEVs，脂肪酸占比显著高于其他 PEVs（GEVs 的脂肪酸含量约为 GPEVs 的 40 倍、GFEVs 的 5.6 倍）；Venn 图显示四种 PEVs 共有的脂质种类为 465 种，GEVs 特有的脂质种类达 400 种，显著多于其他 PEVs（GFEVs 29 种、LEVs 87 种、GPEVs 40 种），进一步证实 GEVs 脂质组成的独特性。
值得注意的是，脂质组学分析在 GEVs 中检测到 6 - 姜酚、8 - 姜酚、10 - 姜酚、6 - 姜辣素、8 - 姜辣素、10 - 姜辣素等具有细胞毒性的成分，HPLC 验证结果显示，GEVs 中确实存在 6 - 姜酚、8 - 姜酚、10 - 姜酚、6 - 姜辣素、8 - 姜辣素（10 - 姜辣素因含量低于检测限未被检出）；CCK-8 实验显示，这些姜酚和姜辣素成分对 B16F10 细胞具有浓度依赖性毒性，当浓度达到 200 μM 时，细胞活力显著下降，这为 GEVs 的肿瘤细胞抑制活性提供了物质基础。
体外细胞实验结果显示，四种 PEVs 中仅 GEVs 对 B16F10 细胞具有显著毒性，且呈浓度依赖性：当 GEVs 浓度达到 10¹⁰ EVs/mL 时，细胞相对活力显著降低（P<0.0001），而 GFEVs、LEVs、GPEVs 即使在 10¹⁰ EVs/mL 浓度下也未表现出明显毒性；IVIS 成像结果与 CCK-8 一致，GEVs 浓度越高，B16F10-Luc 细胞的荧光信号越弱，进一步证实 GEVs 的细胞毒性。细胞增殖实验显示，经 1×10⁹、5×10⁹、10×10⁹ EVs/mL GEVs 预处理的 B16F10 细胞，在培养 7 天后的细胞数量分别为 1.7×10⁵、5.8×10⁴、0.02×10⁵个，显著低于对照组（2.3×10⁵个）；集落形成实验中，对照组形成 144 个集落，而 1×10⁹、5×10⁹、10×10⁹ EVs/mL GEVs 处理组分别形成 99 个、49 个、1 个集落，且即使 1×10⁹ EVs/mL GEVs（24 小时 CCK-8 实验中无明显毒性）也能在 7 天培养期内抑制细胞增殖，提示 GEVs 对肿瘤细胞具有长期抑制作用。活死细胞染色显示，GEVs 处理组的红色荧光（死细胞）随浓度增加而增多，绿色荧光（活细胞）减少；Annexin V-FITC/PI 流式分析显示，GEVs 处理组的凋亡率显著高于对照组，且以晚期凋亡为主；TUNEL 染色显示，GEVs 处理组的绿色荧光（凋亡细胞）显著多于对照组，这些结果共同证实 GEVs 可诱导肿瘤细胞凋亡。
GEV-iRGD 的靶向性实验结果显示，体外细胞摄取实验中，GEV-iRGD 的细胞摄取效率显著高于未修饰 GEVs：流式分析显示，10⁸ EVs/mL GEV-iRGD 处理组的荧光强度是 GEVs 组的 1.8 倍（P<0.0001）；CLSM 观察显示，GEV-iRGD 处理组的细胞质绿色荧光更强，证实其更强的细胞内化能力。体内生物分布实验中，IVIS 成像显示，GEV-iRGD 在肿瘤组织中的荧光辐射效率显著高于 GEVs，且在注射后 72 小时仍保持较高富集水平；而在肝脏组织中，GEV-iRGD 的荧光强度显著低于 GEVs（注射后 4 小时差异最明显，P=0.0325）；冰冻切片 CLSM 观察显示，肿瘤组织中 GEV-iRGD 的 Cy5 荧光信号更强，肝脏组织中则相反，证实 GEV-iRGD 具有良好的肿瘤靶向性和富集能力。
体内肿瘤抑制实验结果显示，对照组肿瘤体积在 14 天内快速增长至约 1800 mm³，而 GEVs 组和 GEV-iRGD 组的肿瘤体积分别约为 1000 mm³ 和 600 mm³，且 GEV-iRGD 组的肿瘤重量（0.404±0.126 g）显著低于 GEVs 组（0.763±0.097 g）和对照组（1.082±0.140 g）；小鼠体重变化显示，三组小鼠的体重均呈缓慢增长趋势，且 GEV-iRGD 组未出现明显体重下降，而 GEVs 组在首次注射后出现短暂体重下降，提示 iRGD 修饰可降低 GEVs 的潜在副作用。组织学分析显示，GEV-iRGD 组肿瘤组织出现明显的细胞坏死（H&E 染色），TUNEL 阳性细胞数量显著多于其他两组，Ki-67 阳性细胞数量显著少于其他两组，证实 GEV-iRGD 可在体内诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖。血液学及生化分析显示，三组小鼠的血常规指标无显著差异；但 GEVs 组的血清 BUN 和 AST 水平显著高于对照组，而 GEV-iRGD 组的 BUN 和 AST 水平与对照组无显著差异，提示 iRGD 修饰可减少 GEVs 在肝脏和肾脏的富集，从而降低其对肝肾功能的潜在影响。
转录组学分析结果显示，PCA 和 Pearson 相关性分析可清晰区分 GEVs 处理组和对照组细胞，提示 GEVs 处理显著改变细胞的转录水平；差异表达基因分析显示，与对照组相比，GEVs 处理组共有 1301 个基因显著上调，2795 个基因显著下调；GO 富集分析显示，差异基因主要参与细胞周期（细胞周期进程、细胞分裂、DNA 复制）、DNA 损伤应答（DNA 损伤修复）、凋亡（凋亡过程正调控、细胞增殖负调控）等生物学过程；KEGG 富集分析显示，差异基因显著富集于细胞周期、DNA 复制、Rap1 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、p53 信号通路、细胞衰老等通路，其中细胞周期和 p53 信号通路与凋亡密切相关。网络分析筛选出 7 个核心基因（Ccnd1、Cdk2、Cdkn1a、Ccne1、Ccne2、Ccnd3、Mdm2），这些基因均参与细胞周期调控和凋亡；qRT-PCR 验证结果显示，GEVs 处理组的 Cdkn1a 和 Mdm2 基因表达显著上调，Ccnd1、Cdk2、Ccne1、Ccne2、Ccnd3 基因表达显著下调，与 RNA-seq 结果一致；体内 IHC 实验显示，GEV-iRGD 处理组肿瘤组织中 CDKN1A（p21，由 Cdkn1a 编码）的表达显著高于对照组，进一步证实 GEVs 可通过调控细胞周期和 p53 信号通路诱导肿瘤细胞凋亡。
蛋白质组学分析结果显示，四种 PEVs 的蛋白含量存在差异：10¹⁰个 GFEVs、GEVs、LEVs、GPEVs 分别提取出 31.38 μg、64.89 μg、11.19 μg、8.96 μg 总蛋白；PCA 分析显示，同一 PEVs 的三个生物学重复样本聚类良好，且 GFEVs 与 LEVs 的蛋白质组成相似度较高；Venn 图显示四种 PEVs 共有的蛋白质为 1238 种，GEVs 特有的蛋白质达 1355 种，显著多于其他 PEVs；将四种 PEVs 的蛋白质与 Vesiclepedia 数据库中哺乳动物 EVs 的标志物对比，发现 24 种蛋白质重叠；进一步分析每种 PEVs 中表达量前 200 的蛋白质，筛选出在四种 PEVs 中均高表达且属于上述重叠蛋白的三种蛋白质：热休克蛋白 70（V4UFD6）、泛素 - 60S 核糖体蛋白 L40（A0A438JSE9）、肌动蛋白（F6HJM9）、延伸因子 1-α（V4SBI0），其中热休克蛋白 70、肌动蛋白、延伸因子 1-α 在四种 PEVs 中均位于表达量前 100 位，因此被认为是 PEVs 的潜在标志物。目前由于缺乏针对这些植物蛋白的商业化抗体，尚未能进一步验证其作为标志物的可靠性，但未来商业化抗体的开发将为 PEVs 的分离、鉴定及质量控制提供关键工具。