Cell Res | Stereo-seq揭示人类肝癌浸润区促进肝细胞-肿瘤细胞串扰、局部免疫抑制和肿瘤进展

有同学给了一篇23年的空间文章，研究的一个核心概念是肿瘤边缘的"侵袭区"，文章中定义的是以肿瘤边缘为中心的500微米宽的区域，这里是肿瘤细胞侵袭和转移的活跃前沿，包含复杂的细胞成分及独特的分子特征，存在免疫抑制微环境、肿瘤细胞代谢重编程及受损肝细胞，对肿瘤进展和患者预后有关键影响。这个区域在肿瘤侵袭和转移中具有重要地位，文章后续都是围绕其位置、细胞组成、分子特征以及功能作用进行详细描述。想要实现下面两张图结果：

文章题目：An Invasive Zone in Human Liver Cancer Identifified by Stereo-seq Promotes Hepatocyte–Tumor Cell Crosstalk, Local Immunosuppression and Tumor Progression

发表时间：2023-06-19

发表期刊：Cell Research

研究背景

      肿瘤生态系统的复杂性 肿瘤异质性：肿瘤是一种高度异质性的疾病，其异质性不仅体现在不同患者的肿瘤之间存在差异，还体现在同一肿瘤内部的不同区域之间。肿瘤细胞在遗传背景、基因表达、细胞形态和功能等方面存在着显著的异质性，这种异质性使得肿瘤对治疗的反应难以预测，也给精准治疗带来了巨大挑战。肿瘤边缘区域是指肿瘤组织与周围正常组织交界的区域，这里是肿瘤细胞侵袭和转移的最活跃区域。在这一区域，肿瘤细胞与正常组织细胞以及肿瘤微环境中的各种成分相互接触和相互作用，发生了一系列复杂的生物学行为改变，如细胞运动、细胞外基质降解、细胞黏附等，为肿瘤的侵袭和转移提供了条件。 免疫逃逸的关键环节：肿瘤边缘区域也是肿瘤免疫逃逸的关键环节。免疫细胞在肿瘤边缘区域的浸润和分布情况与肿瘤的预后密切相关。研究表明，某些免疫细胞在肿瘤边缘区域的浸润能够抑制肿瘤的生长和转移，而另一些免疫细胞则可能通过分泌免疫抑制性细胞因子等方式，帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的监视和杀伤。

创新点  

      提出了肝癌 “侵袭区” 的新概念，并详细描述了其独特的细胞组成、空间分布和分子特征，为深入理解肿瘤侵袭和转移的机制提供了关键线索。 揭示细胞间相互作用机制 ：精准解析了肿瘤细胞、肝细胞和巨噬细胞之间复杂的相互作用网络，特别是发现了 CXCL6-SAA-TLR2 信号轴在肿瘤免疫微环境调控中的关键作用，为肝癌治疗提供了新的靶点和理论依据。 临床转化意义 ：通过对多个独立队列的临床数据分析，证实了侵袭区内 SAAs 表达水平与肝癌患者预后的密切关系，为临床诊断和治疗提供了潜在的生物标志物和治疗靶点。

结果

原发性肝癌四个组织区域的空间转录异质性

      以scRNA-seq数据为参考，利用SPOTlight计算组织切片中每个点（bin 50）的细胞成分，共注释得到了9种主要细胞类型：B细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肝细胞、内皮细胞、成纤维细胞，以及其他两种细胞类型（肿瘤细胞和胆管细胞合并为一种主要细胞类型；T细胞和NK细胞合并为一种主要细胞类型）。

      根据病理学家基于相邻H&E染色图像确定的肿瘤边界，边缘区域在空间上分为边缘区域的肿瘤相邻部分 (tumor-adjacent part of margin areas，M-T) 和肿瘤旁部分 (paratumor part of margin areas，M-P)。肝癌中四个区域（T、M、P和LN）的细胞组成和空间分布具有高度异质性，除主要的肿瘤细胞和肝细胞外，T/NK细胞、B细胞和成纤维细胞是最丰富的细胞。在空间上，巨噬细胞等免疫细胞主要富集在肿瘤边界的边缘区域，表明肿瘤边界周围存在独特的免疫微环境。

 a 主要细胞类型在肝细胞癌患者多个区域（LC5-T、M、P、LN；LC20-M；LC4-LN）中的分布。b 展示四个区域（T，n = 12；M，n = 21；P，n = 10；LN，n = 10）中所有细胞成分中主要细胞类型百分比的箱线图，不包括实质细胞。根据肿瘤边界的位置，边缘区域进一步分为肿瘤部分（M-T）和肿瘤旁部分（M-P）。c 展示四个区域（LC5-T、M、P、LN）中主要细胞类型空间分布和聚集的三维图。d 展示基于 Stereo-seq 数据的五个区域（T，n = 12；M-T，n = 21；M-P，n = 21；P，n = 10；LN，n = 10）通路基因集变异分析（GSVA）分数的小提琴图。使用 Student's t 检验评估图 b 中差异的显著性。*P < 0.05；***P < 0.001。M-T，边缘肿瘤侧；M-P，边缘肿瘤旁侧。

侵袭区的特征为免疫抑制性微环境、肿瘤细胞的代谢重编程和严重受损的肝细胞

a 使用 Stereo-seq 数据在边缘区域构建肿瘤边缘 SDM 的示意图。b 线图显示使用 Stereo-seq 数据确定的人肝肿瘤边缘周围不同层中所有细胞成分的平均免疫细胞比例和不同亚群（B 细胞、巨噬细胞、T/NK 细胞、DC 和浆细胞）。“远处”定义为肿瘤组织或至少 2 毫米远离边缘的肿瘤旁组织 250 微米宽的区域。c 一例代表性 ICC 患者组织的多重免疫荧光染色（ARG1、CK19、CD68 和 DAPI）。ARG1、CK19 和 CD68 分别是肝细胞、恶性细胞和巨噬细胞的标志物。d 盒形图分析来自验证队列 1 中 105 例肝癌患者（HCC，n=53；ICC，n=52）组织边缘肿瘤侧和肿瘤旁侧不同层（轴向长度 1000 微米）中巨噬细胞（CD68 细胞）的平均数量。 e 线图显示基于 Stereoseq 数据从 16 例肝癌患者组织样本制作的切片边缘不同层中免疫检查点基因（CD96、IDO1、TIGIT、BTLA 和 CTLA4）的表达水平。f, g 线图显示基于 Stereoseq 数据从 16 例肝癌样本边缘不同层中癌症不同标志物的 GSVA 评分，包括血管生成、细胞凋亡、免疫逃逸、EMT、G2M 和缺氧（f）以及代谢途径，包括糖酵解、谷氨酰胺代谢、三羧酸（TCA）循环、脂肪酸酰基 CoA 合成和脂肪酸β-氧化（g）。h 层次聚类显示沿边缘的转录异质性，并说明从 16 例肝癌患者组织中的浸润区总共 2912 个等分亚区域中获得的细胞组成模式特征。亚区域的特征分为 5 种模式。i 热图显示与图 h 对应的 5 种分组模式的细胞类型组成和比例。j 条形图显示复发富集分数，显示每种模式的预后关联。 学生 t 检验用于评估 b、d-g 面板中差异的统计学显著性，而卡方检验用于面板 j。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。

侵袭区JAK-STAT3激活诱导受损肝细胞亚型SAAs的高表达

a 基于 Stereo-seq 数据（LC5-M）和相邻冷冻切片的 IF 染色（HNF4α、SAAs 和 4'-6'-二氨基-2-苯基吲哚，DAPI）显示的边缘区域 Hep1 和 Hep2 亚型的空间分布点图。HNF4α是识别肝细胞的标志物。b 基于 Stereo-seq 数据（LC5-M）的火山图显示两个肝细胞簇（Hep1 和 Hep2）之间的差异表达基因（DEGs）。红色点代表在 Hep1 中上调的基因，蓝色点代表在 Hep2 中上调的基因。c 使用批量 RNA 测序确定来自验证队列 2 的 10 名 ICC 患者的肿瘤、边缘区域（以边界为中心的 1 厘米宽区域）和肿瘤旁组织的 SAA1 和 SAA2 的表达水平。d Stereoseq 数据（LC2-M）和 scRNA-seq 数据中 Hep1 中上调基因的重叠。e 基于 scRNA-seq 和 Stereo-seq 数据（LC2-M）显示与 Hep2 亚型相比，Hep1 亚型中常见上调基因富集途径的气泡图。 k 是查询集与数据库集合交集中的基因数量，K 是数据库集合中的基因数量。f 基于 scRNA-seq 数据，使用 SCENIC 分析比较 Hep1 和 Hep2 亚型中差异表达转录因子的热图。g 根据 scRNA-seq 数据，显示 STAT3 和 SAA1（左面板）或 SAA2（右面板）转录水平之间相互作用的散点图。h 多重免疫荧光染色（ARG1、STAT3、SAAs 和 DAPI）显示 STAT3 在浸润区 SAAs 肝细胞中的高表达（来自验证队列 4 的代表性 ICC 患者）。i 根据 scRNA-seq 数据，显示 Hep1 肝细胞中 JAK-STAT3 通路 GSVA 评分与 SAA1（左面板）或 SAA2（右面板）之间的相关性散点图。j 基于 scRNA-seq 数据，显示恶性细胞簇 3（C3）中上调基因与由 Stereo-seq 数据指示的 Hep1 富集区域肿瘤细胞之间的重叠（LC2-M）。k 表示基于 scRNA-seq 数据，C3 和其他恶性细胞簇中 EMT GSVA 评分的箱线图。 多重免疫荧光染色（CXCL6、SAAs、CK19 和 DAPI）显示肿瘤细胞靠近 SAAs 周围肝细胞边缘的高 CXCL6 表达（验证队列 4 的 ICC 患者）。在图 c 中使用了 Student's t 检验进行分析，在图 d、j 中使用了超几何检验，在图 k 中使用了 Wilcoxon 检验。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。

SAAs+肝细胞亚型有助于巨噬细胞的募集和M2极化

a 根据 scRNA-seq 数据，显示肝细胞与其他细胞类型之间的细胞间相互作用。线宽表示显著配体-受体对的数量，箭头指向提供受体的细胞类型。b 使用 scRNA-seq 数据通过 CellPhone 计算的肝细胞与其他细胞类型之间的显著配体-受体对气泡图。c 根据 scRNA-seq 数据和 Stereo-seq 斑点（LC2-M），显示 SAAs 受体（包括 CD36、FPR1/2、SCARB1、TLR2 和 TLR4）在主要细胞类型中的基因表达水平气泡图。d 根据来自 5 名患者边缘区域和肿瘤组织的 scRNA-seq 数据，显示巨噬细胞中 SAAs 受体基因的表达水平气泡图。e 左面板上的 LC5-M 玻片上 Hep1 肝细胞（绿色点）和巨噬细胞（红色点）的分布散点图。中间面板显示 Hep1 中 SAAs 的表达散点图，右面板显示 LC5-M 玻片上巨噬细胞中 SAAs 受体的表达散点图。 虚线代表边界。f 分析了 16 例肝癌患者样本中肿瘤边界侧不同层中 SAA 受体（CD36、FPR1/2、SCARB1、TLR2 和/或 TLR4）阳性巨噬细胞的平均数量箱线图。g, h 验证队列 4 中 HCC 和 ICC 样本的侵袭区中 FPR1 巨噬细胞（FPR1CD68 细胞）和 SAA 肝细胞（SAAsARG1 细胞）共聚集的多重免疫荧光染色（ARG1、CK19、FPR1、CD68、SAAs 和 DAPI）。i 对 56 例肝癌患者边缘区域（包括 27 例原发性肝癌和 29 例继发性肝癌）中不同层（轴向长度 1000 μm）FPR1 巨噬细胞（FPR1CD68 细胞）和 SAA 肝细胞（SAAsARG1 细胞）数量的定量分析（验证队列 4）。“远处”定义为距离边界至少 2 mm 的肿瘤组织或肿瘤旁组织 250 μm 宽的区域。j 散点图说明了来自验证队列 4 中 27 例原发性肝癌患者的样本中侵袭区（轴向长度 1000 μm）巨噬细胞数量与 SAA 肝细胞数量之间的相关性。在 f、i 面板中使用了配对 Student's t 检验。 *P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。

肿瘤边界定义实现方法