16S18S基础知识（1）

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微生物学研究的发展趋势

1. 1676年：荷兰科学家列文虎克（Antonie van Leeuwenhoek）首次报告了他对口腔微生物的观察结果。他使用自制的显微镜观察到了微生物的存在。

2. 1888年：德国科学家罗伯特·科赫（Robert Koch）使用固体培养基分离出了微生物，并提出了著名的科赫法则，这是确定病原体与疾病关系的一套标准。

3. 1931年：卡尔·沃斯（Carl R. Woese）提出了微生物生态学的概念，这是微生物学的一个重要分支，研究微生物与其环境之间的相互作用。

4. 1977年：弗雷德·桑格（Fred Sanger）开发了DNA测序技术，这是现代分子生物学的基石之一，使得科学家能够读取DNA序列。

5. 1980年：凯里·穆利斯（Kary Mullis）开发了聚合酶链式反应（PCR），这是一种在实验室中快速复制特定DNA片段的技术。

6. 1990年：汉密尔顿等人提出了“宏基因组学”（metagenomics）的概念，这是一种研究环境样本中所有遗传物质的方法。

7. 1998年：乔瓦尼等人进行了首次基于16S rRNA的微生物群落研究，这是微生物分类和生态学研究中的一个重要工具。

8. 2005年：第一台下一代测序（NGS）机器由罗氏（Roche）公司发布，这标志着测序技术的一个重大进步，使得大规模基因组测序成为可能。

9. 2006年：Solexa公司（后被Illumina收购）发布了基因分析仪（GA sequencer），这是另一种下一代测序技术，进一步提高了测序的速度和通量。

10. 2008年：人类微生物组计划（Human Microbiome Project）公布，这是一项旨在绘制人体微生物组图谱的大规模研究项目。

11. 2011年：PacBio RS测序仪发布，这是一种单分子实时测序技术，能够提供更长的读长。

12. 2015年：海洋采样日（Ocean Sampling Day）活动，这是一项全球性的微生物采样活动，旨在收集和分析海洋微生物样本。

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原核生物的核糖体由两个亚基组成，分别是大亚基和小亚基，每个亚基都由核糖体RNA（rRNA）和多个蛋白质组成。以下是按照您给出的格式进行的详细介绍：

原核生物核糖体大亚基

• 组成：
  • 核糖体RNA（rRNA）：
    • 23S rRNA：包含约2900个核苷酸（nNts），是大亚基中的主要rRNA成分。
    • 5S rRNA：包含约120个核苷酸（nNts），是大亚基中的次要rRNA成分。
  • 蛋白质：总共31个不同的蛋白质分子。
• 功能：大亚基在蛋白质合成过程中负责肽链的延伸和释放。

原核生物核糖体小亚基

• 组成：
  • 核糖体RNA（rRNA）：
    • 16S rRNA：包含约1500个核苷酸（nNts），是小亚基中唯一的rRNA成分。
  • 蛋白质：总共21个不同的蛋白质分子。
• 功能：小亚基在蛋白质合成过程中负责识别mRNA上的起始密码子和tRNA的反密码子。

核糖体的组装

• 组装后的核糖体：由50S大亚基和30S小亚基组装而成，形成完整的70S核糖体。
• 功能：70S核糖体负责将mRNA上的遗传信息翻译成蛋白质，是细胞内蛋白质合成的关键分子机器。

这种结构和组成使得原核生物的核糖体能够高效地进行蛋白质合成，适应快速的代谢需求。

真核生物核糖体大亚基

• 组成：
  • 核糖体RNA（rRNA）：
    • 28S rRNA：包含约4900个核苷酸（nNts），是大亚基中的主要rRNA成分。
    • 5.8S rRNA：包含约160个核苷酸（nNts），是大亚基中的次要rRNA成分。
    • 5S rRNA：包含约120个核苷酸（nNts），是大亚基中的另一个次要rRNA成分。
  • 蛋白质：总共50个不同的蛋白质分子。
• 功能：大亚基在蛋白质合成过程中负责肽链的延伸和释放。

真核生物核糖体小亚基

• 组成：
  • 核糖体RNA（rRNA）：
    • 18S rRNA：包含约1900个核苷酸（nNts），是小亚基中唯一的rRNA成分。
  • 蛋白质：总共33个不同的蛋白质分子。
• 功能：小亚基在蛋白质合成过程中负责识别mRNA上的起始密码子和tRNA的反密码子。

核糖体的组装

• 组装后的核糖体：由60S大亚基和40S小亚基组装而成，形成完整的80S核糖体。
• 功能：80S核糖体负责将mRNA上的遗传信息翻译成蛋白质，是细胞内蛋白质合成的关键分子机器。

真核生物与原核生物核糖体的比较

• 大小：真核生物的核糖体（80S）比原核生物的核糖体（70S）更大。
• rRNA种类和数量：真核生物的核糖体包含更多的rRNA种类（28S、5.8S、5S和18S），而原核生物的核糖体主要包含23S和16S rRNA。
• 蛋白质数量：真核生物的核糖体包含更多的蛋白质分子（大亚基50个，小亚基33个），而原核生物的核糖体包含较少的蛋白质分子（大亚基31个，小亚基21个）。

这种结构和组成的差异反映了真核生物与原核生物在进化过程中的不同适应性变化，也影响了它们在蛋白质合成过程中的效率和调控机制。真核生物的核糖体通常具有更复杂的结构和调控机制，以适应其复杂的细胞环境和多样的蛋白质合成需求。

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为什么选择16S rRNA

高度的保守性

• 解释：rRNA在不同物种间具有高度保守性，这意味着它们的序列在进化过程中变化很小。
• 用途：这种保守性使得rRNA可以反映微生物之间的亲缘关系，因此被广泛用于物种分类和系统发生学研究。

种间存在差异

• 解释：尽管rRNA在种内保守，但在不同物种之间存在足够的差异。
• 用途：这些差异可以作为微生物多样性分析的分子基础，帮助科学家区分不同的微生物种类。

长度适中（为什么选择16S rRNA）

• 解释：16S rRNA基因全长约1500bp（碱基对），占细菌总RNA量的80%以上。
• 优势：
  • 基因序列长度适中：既包含了足够的信息来区分不同的细菌种类，又不会因为过长而难以处理。
  • 结构特点：16S rRNA的结构中既有保守区域，又有可变区域，这使得它成为较好的生物标志物。
    • 保守区域：在所有细菌中都非常相似，可以用于设计通用引物进行PCR扩增。
    • 可变区域：在不同细菌中存在差异，可以用于区分不同的细菌种类。

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为什么选择V3和V4区

图中标记的元素

• Sample Barcode：样本条形码，用于区分不同的样本。
• Primer Sequence：引物序列，用于PCR扩增V3和V4区域。
• Targeted Region：目标测序区域，即V3和V4区域。
• Constant Region：保守区域，用于设计引物。

16S rRNA基因的结构

16S rRNA基因是原核生物中高度保守的基因，其基因序列长度约为1540bp（碱基对）。16S rRNA基因可以分为多个可变区域（Variable Regions）即：V和保守区域（Constant Regions）。这些区域在不同的细菌中具有不同的变异程度，因此可以用于细菌的分类和鉴定。

可变区域和保守区域

• 可变区域（Variable Regions）：这些区域在不同细菌中具有较高的变异性，可以用于区分不同的细菌种类。图中标记了V1到V9区域，其中V3和V4是常用的测序区域。
• 保守区域（Constant Regions）：这些区域在不同细菌中具有高度保守性，通常用于设计引物。

为什么选择V3+V4区域

• V3和V4区域：这两个区域位于16S rRNA基因的中部，具有适中的变异性，既能反映不同细菌之间的差异，又不会因为变异过大而难以比对。
• 引物设计：V3和V4区域的保守性使得可以设计通用引物进行PCR扩增，从而对这些区域进行测序。
• 测序效率：选择V3和V4区域可以提高测序效率，因为这些区域的序列长度适中，既包含了足够的信息，又不会因为过长而增加测序难度。

测序技术的发展历程经历了三代，每一代测序技术都有其特定的优势和局限性。在选择16S rRNA基因的V3和V4区域进行测序时，需要考虑测序平台的读长（read length）能力。以下是结合不同代测序技术以及Illumina平台的MiSeq仪器来说明为什么选择V3和V4区域：

第1代测序技术（Sanger测序）

• 读长：通常在700-1000bp之间。
• 特点：准确度高，但通量低，成本高。
• 16S rRNA测序：理论上可以覆盖整个16S rRNA基因，但由于成本和通量的限制，不常使用。
  在微生物生态学研究中，通常需要对成百上千个样本进行测序，以分析微生物群落的多样性和结构。Sanger测序的低通量无法满足这种大规模分析的需求。

第2代测序技术（Next-Generation Sequencing, NGS）

• 读长：通常在50-300bp之间，但通量高，成本相对较低。
• 特点：高通量，适合大规模样本的测序，但读长较短，可能需要拼接来覆盖整个基因。
• 16S rRNA测序：由于读长限制，通常选择16S rRNA基因中变异性较高的区域进行测序，如V3、V4、V5等。

第3代测序技术（Third-Generation Sequencing）

• 读长：通常在1000bp以上，甚至可以达到10kb以上。
• 特点：长读长，可以覆盖整个16S rRNA基因，但错误率相对较高，需要更复杂的数据处理。
• 16S rRNA测序：理论上可以覆盖整个基因，但考虑到错误率和成本，可能仍然选择特定的区域进行测序。

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真菌

真菌ITS测序

• 定义：ITS（Internal Transcribed Spacer）是指核糖体RNA基因之间的非编码序列，包括ITS1和ITS2。
• 特点：
  • 多样性研究：ITS测序主要用于真菌多样性的研究，因为ITS区域在不同真菌物种间具有较高的变异性。
  • 高准确度：ITS区域的变异性使得它在物种鉴定和分类中具有较高的准确度。
• 应用：由于ITS区域的高变异性，它被广泛用于真菌的分类学研究和生态学研究。

真核18S测序

• 定义：18S rRNA基因是真核生物核糖体大亚基中的一个组成部分，其基因序列在真核生物中相对保守。
• 特点：
  • 广范围注释：18S rRNA基因可以用于真核微生物的分类，但相比真菌的ITS区域，其精确度相对较低。
  • 低精确度：由于18S rRNA基因在不同真核生物间的变化较小，因此在真菌分类中的精确度不如ITS区域。
• 应用：18S rRNA基因常用于真核生物的系统发育分析和分类学研究。

测序方案的选择

• 根据研究目的：可以根据研究的具体目的选择合适的测序方案。例如，如果研究重点是真菌多样性，可能会选择ITS测序；如果研究重点是真核微生物的系统发育关系，可能会选择18S rRNA基因测序。

总结

真菌ITS和真核18S rRNA基因在测序分析中各有优势。ITS区域因其高变异性适用于真菌多样性研究，而18S rRNA基因则适用于更广泛的真核微生物分类。研究者可以根据具体的研究目的和需求，合理选择测序方案。