Cell | 大规模 单细胞图谱 揭示非小细胞肺癌抗PD-1治疗后的免疫微环境异质性

–https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.03.018

A single-cell atlas reveals immune heterogeneity in anti-PD-1-treated non-small cell lung cancer

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研究简介

背景与问题

非小细胞肺癌（NSCLC）术后复发率高。新辅助免疫治疗联合化疗提高了疗效，但患者间反应差异大，其异质性机制尚不明确，急需深入了解。

肿瘤免疫微环境（TIME）是免疫治疗反应的关键。单细胞测序技术有助于分析TIME，但既往研究队列小，难以全面探索患者群体层面的反应异质性。

本研究方法

研究组建了一个大型队列（234例）接受新辅助免疫治疗联合化疗的NSCLC患者。利用单细胞RNA和T细胞受体测序（scRNA/TCR-seq）对治疗后肿瘤样本进行了详细分析。

主要发现：

• 对234例接受抗PD-1治疗的非小细胞肺癌患者的分析揭示了5种TIME亚型
• NK细胞、记忆性B细胞和前体耗竭T细胞与MPR相关
• T细胞克隆扩增特征可识别非MPR患者的异质性
• Tex相关细胞中Texp细胞的比例与无复发生存期相关

研究意义

为局部晚期NSCLC患者接受新辅助抗PD-1阻断治疗后的个体化反应预测和分层提供了重要见解。

研究结果

1.抗PD-1治疗的NSCLC肿瘤浸润性免疫细胞的大规模图谱

样本基本情况

研究前瞻性随访了334例新诊断、未经治疗的LUSC（245名）或LUAD（89名）患者（排除了EGFR突变或ALK重排患者），这些患者接受了抗PD-1联合化疗作为新辅助治疗。

对术后切除的肿瘤进行病理评估，通过计算总肿瘤床面积中残留活肿瘤百分比（RVT%）来衡量病理反应率（1-RVT%）：

• 主要病理反应 (MPR)： RVT% ≤ 10%。这是后续分析的主要分层依据
• 病理完全缓解 (pCR)： 在达到MPR的患者中，原发肿瘤和任何淋巴结的RVT%均为0%

观察到患者中的MPR率为57.2%，其中pCR率为39.2%：

临床因素与MPR

单变量logistic回归分析显示，治疗持续时间和不同类型的抗PD-1药物与MPR无显著相关性，这表明需要进一步研究不同反应程度的深层机制，特别是TIME的异质性。

单细胞测序分析

对随访的334例患者中234例患者术后切除的肿瘤进行了高质量的scRNA/TCR-seq分析，质控：

从scRNA-seq数据中分选并注释了CD45+免疫细胞，最终获得了包含1,254,749个肿瘤浸润性免疫细胞的高质量图谱。该图谱详细解析出51种免疫细胞亚型，涵盖了肿瘤浸润性T细胞、自然杀伤（NK）细胞、B细胞和髓系细胞：

细胞亚型的具体biomarker如下：

2.免疫细胞亚群丰度分析揭示了五种TIME亚型

TIME亚型的识别

研究通过计算每位患者总CD45+细胞中各种免疫细胞亚型的比例，并应用非负矩阵分解（NMF）方法，对222名患者的肿瘤免疫微环境（TIME）异质性进行了探索。通过确定NMF的最佳秩，研究最终将TIME异质性分为五种不同的亚型。每位患者被分配到一种TIME亚型进行后续分析:

• TIME-NK： 富含NK细胞和NK样T细胞。
• TIME-BE： 富含B细胞。
• TIME-Teff： 富含效应T细胞。
• TIME-Treg： 富含调节性T细胞（Treg）。
• TIME-Mye： 富含髓系细胞。

TIME亚型与治疗反应的关系：

不同TIME亚型的患者表现出不同的主要病理反应率（MPR率）。其中，TIME-NK、TIME-BE和TIME-Teff亚型显示出较高的MPR率，而TIME-Treg和TIME-Mye亚型则MPR率较低：

此外，TIME-Treg亚型患者的治疗前PD-L1 TPS评分通常低于TIME-Teff患者：

在TIME-Teff亚型中，肺腺癌（LUAD）患者的MPR率低于肺鳞癌（LUSC）患者：

这与随访的所有334名患者数据中LUAD患者MPR率低于LUSC患者的趋势一致，表明观察到的差异不是由于抽样偏差：

3.FGFBP2+ NK/NK样T细胞在TIME-NK患者中富集

研究发现在实现主要病理反应（MPR）的TIME-NK亚型患者中，两种特定的FGFBP2+细胞亚群——NK_CD16hi_FGFBP2细胞和CD8T_NK-like_FGFBP2细胞——水平最高。这两种细胞是研究识别出的三种NK/NK样T细胞亚型中的两种：

FGFBP2+细胞的细胞毒性特征与功能：

这些FGFBP2+细胞亚群，特别是CD8T_NK-like_FGFBP2细胞，同时表达CD8+ T细胞和NK细胞标记，并表现出比NK_CD16low_GZMK细胞更高的细胞毒性相关基因（PRF1和GZMB）表达，表明其细胞毒性潜力增强：

CD8T_NK-like_FGFBP2细胞还表达TCR基因：

并在TIME-NK患者中显示出最高的克隆扩增水平，这些特征提示它们在肿瘤清除中可能发挥重要作用：

FGFBP2+细胞与化疗反应的关联：

值得注意的是，这两种FGFBP2+细胞亚群均不表达PDCD1（编码PD-1），这表明它们可能不受抗PD-1药物的直接影响，并且可能参与了与T细胞耗竭不同的发育途径：

重要的是，CD8T_NK-like_FGFBP2细胞在新辅助化疗alone获得MPR的NSCLC患者中富集，并且在响应化疗的乳腺癌患者中也观察到FGFBP2+细胞的富集。体外实验也证实化疗药物（如卡铂、顺铂）预处理可以增强NK细胞的杀伤效率：

4.在TIME-BE患者中观察到B细胞聚集体的形成

在具有较高主要病理反应率（MPR率）的TIME-BE亚型患者中，肿瘤中存在显著的记忆B细胞浸润。通过CD20免疫染色观察到这些患者的消退肿瘤床中形成了丰富的B细胞聚集体：

且定量分析显示TIME-BE患者的B细胞聚集体数量在所有亚型中最多：

B细胞聚集体可能代表三级淋巴结构（TLSs）：

结合现有研究表明滤泡辅助T细胞（Tfh细胞）和树突状细胞是三级淋巴结构（TLSs）的关键组成部分且与改善的临床结局相关，TIME-BE患者中也存在高水平的Tfh和树突状细胞浸润，这提示这些B细胞聚集体可能代表了TLSs：

成熟TLSs与治疗反应的关联：

通过多重免疫荧光（mIF）技术，研究进一步区分了成熟（CD21+ DC-LAMP+）和不成熟（CD21− DC-LAMP−）的TLSs：

在具有B细胞聚集体的患者中，获得MPR的患者拥有更多数量的成熟TLSs，这表明成熟TLSs在促进免疫治疗反应中发挥重要作用：

总体而言，研究数据表明TIME-BE亚型代表了一个对化疗免疫治疗高度敏感的患者亚群，这种敏感性可能与肿瘤微环境中成熟三级淋巴结构的形成有关。

5.在TIME-Teff和TIME-Treg患者中富集了不同的T细胞亚群

TIME-Teff和TIME-Treg亚型在T细胞组成上的显著差异：

尽管TIME-Teff和TIME-Treg患者的总T细胞水平相似：

但两者在T细胞亚型丰度和主要病理反应率（MPR率）上存在显著不同。这些差异体现在CD8+和CD4+ T细胞区室：

CD8+ T细胞亚型的对比：

TIME-Teff患者：

在CD8+ T细胞中，TIME-Teff患者富集了粘膜相关不变T细胞（MAITs）、效应记忆T细胞和常驻记忆T细胞等亚型，这些细胞表达早期活化基因,例如IL7R、TCF7和GZMK。相反，TIME-Treg患者则富集了耗竭性T细胞（Tex和终末期Tex），这些细胞表达高水平的免疫检查点分子和CXCL13：

与Tex细胞相比，终末期Tex细胞表达更高水平的检查点分子，并独特地表达LAYN和ENTPD1。

TIME-Treg患者的CD8+ T细胞表现出更高的耗竭和功能障碍特征：

CD4+ T细胞亚型的对比：

在CD4+ T细胞中，TIME-Teff患者主要富集幼稚、记忆和效应记忆CD4+ T细胞，而TIME-Treg患者则显示出调节性T细胞（Treg）、滤泡辅助T细胞（Tfh）和CD4T_Th1-like_CXCL13细胞的增加：

Treg亚型的异质性与分布：

鉴于Treg富集与TIME-Treg患者较低MPR率的相关性，研究进一步分析了Treg亚型的组成。研究识别出三种Treg亚型：增殖性Treg、CCR8- Treg和CCR8+ Treg

与CCR8- Tregs相比，CCR8+ Tregs表达更高水平的TNFRSF4、TNFRSF18和CCR8：

其中CCR8+ Tregs表达高水平的FOXP3、IL2RA和CTLA4，表明具有高免疫抑制潜力。

与TIME-Teff患者相比，TIME-Treg患者显著增加了CCR8+ Tregs和增殖性Tregs的数量：

且这些Treg亚型表达CXCR3，呈现Th1样特征：

通过多重免疫荧光染色也证实了在TIME-Treg患者中FOXP3+ CCR8+细胞数量和比例的增加，进一步支持了TIME-Teff和TIME-Treg亚型富集不同Treg亚型的结论：

6.TIME-Teff和TIME-Treg患者中不同的T细胞扩增模式

使用scTCR-seq分析T细胞克隆扩增：

研究利用scTCR-seq技术，总共识别出144,162个CD8+ T细胞为克隆扩增的CD8+ T细胞，定义为每个检测到的TCR克隆型具有至少3个细胞：

越来越多的证据表明，表达ENTPD1的终末期耗竭CD8+ T细胞来源于肿瘤抗原特异性T细胞，而不是肿瘤非相关T细胞:

研究将扩增的终末期Tex相关CD8+ T细胞，视为肿瘤抗原特异性T细胞的替代指标。作者认为与扩增的终末期Tex细胞共享TCR的CD8+ T细胞将共享相同的抗原特异性，无论其转录特征如何。

因此，研究选择了所有与扩增的终末期Tex细胞共享TCR的CD8+ T细胞，并将这部分T细胞称为Tex相关细胞。

Tex相关细胞包括前体耗竭T细胞（Texp）和扩增的终末期耗竭T细胞（expanded terminal Tex），两者在基因表达上有所差异，其中Texp细胞显示出较低的检查点基因表达和较高的GZMK/IL7R表达：

在214名患者的15,615个扩增的CD8+ T细胞克隆型中，有2,297个（14.7%）是Tex相关克隆型。在144,162个扩增的CD8+ T细胞中，有8,718个（6.0%）和42,399个（29.4%）分别被指定为扩增的终末期Tex细胞和Texp细胞。

Tex相关CD8+ T细胞组成的差异与MPR相关性：

TIME-Teff和TIME-Treg患者的Tex相关克隆型总数和整体扩增水平相似：

然而，TIME-Teff患者在总Tex相关细胞中表现出Texp细胞丰度增加，而TIME-Treg患者在Tex相关细胞中观察到更高比例的终末期Tex细胞：

这一发现与Texp细胞被认为与治疗反应相关，以及终末期Tex细胞比例较高与较低MPR率之间的关联相符。

CCR8+调节性T细胞的克隆扩增模式：

研究还分析了被认为具有高免疫抑制潜力的CCR8+调节性T细胞（Tregs）的克隆扩增。扩增的CCR8+ Tregs定义为每个克隆型具有至少3个细胞的CCR8+ Tregs：

在214名患者中共识别出1,672个扩增的CCR8+ Treg克隆型。

结果显示，与TIME-Teff患者相比，TIME-Treg患者拥有更多数量的扩增CCR8+ Treg克隆型，且这些克隆型的克隆扩增水平也更高：

总体而言，研究数据表明TIME-Teff和TIME-Treg患者不同的主要病理反应率（MPR率）与肿瘤浸润性T细胞不同的克隆扩增模式密切相关。

高MPR率的TIME-Teff患者倾向于在Tex相关细胞中富集Texp细胞，而低MPR率的TIME-Treg患者则表现出Tex相关细胞中终末期Tex细胞比例的增加以及高免疫抑制性CCR8+ Treg克隆型的显著扩增：

7.五种TIME亚型中的T细胞扩增状态

跨TIME亚型和MPR/非MPR患者的T细胞扩增分析范围：

研究扩展了T细胞扩增状态的分析，涵盖了所有五种TIME亚型中的MPR和非MPR患者亚群：

整体来看，TIME-Treg患者显示出最多的Tex相关克隆型和扩增的CCR8+ Treg克隆型数量：

研究比较了同一TIME亚型中MPR和非MPR患者的T细胞扩增状态。同一TIME亚型中的MPR和非MPR患者在总CD45+细胞中的T细胞丰度相当：

在同一TIME亚型内比较MPR和非MPR患者时，观察到非MPR患者倾向于某些与较低反应相关的T细胞特征，如Texp细胞比例降低、Tex相关细胞扩增减少以及CCR8+ Tregs比例增加的趋势：

非MPR患者的异质性及基于Treg扩增的分类：

研究发现未达到MPR的患者群体内部存在显著异质性。通过分析所有患者的T细胞克隆型数量，研究根据扩增的CCR8+ Treg克隆型数量（高于上四分位数R9）将非MPR患者分为Treghi非MPR患者（高Treg扩增）和Treglow非MPR患者（低Treg扩增）：

Treghi非MPR患者的扩增CCR8+ Treg克隆型数量远高于其他组，并且这类患者分布在所有五种TIME亚型中，而非MPR的TIME-NK、TIME-BE和TIME-Mye患者则大多属于Treglow亚群：

Treg扩增分类的验证：

通过对肿瘤样本进行CCR8免疫染色，研究证实了Treghi非MPR患者相比于Treglow非MPR患者具有更高数量和比例的CCR8+细胞/Tregs，从而在组织层面验证了基于CCR8+ Treg克隆扩增进行的患者分类：

不同结局患者亚群的T细胞扩增模式对比：

进一步比较显示，Treghi非MPR患者拥有显著更多的Tex相关克隆型和更高的Tex相关细胞扩增程度，但其Tex相关细胞中Texp细胞比例最低，Treglow非MPR患者的Tex相关克隆型数量与MPR患者相似，但也显示出Texp细胞比例降低的趋势：

同时，Treghi非MPR患者的CCR8+ Tregs扩增显著增加且在所有Tregs中所占比例更高：

这些数据表明，未达到MPR的患者群体并非同质：Treghi非MPR患者在T细胞扩增模式上与MPR患者显著不同，而Treglow非MPR患者更接近MPR患者，但在Tex相关细胞扩增和CCR8+ Tregs比例上也存在差异。两种非MPR亚型都趋向于在Tex相关细胞中Texp细胞比例较低。

8.五种TIME亚型中的T细胞扩增状态

无复发生存期（RFS）与TIME亚型及PRR的关系：

研究对159名患者进行了新辅助免疫治疗后无复发生存期（RFS）分析，发现不同TIME亚型的患者表现出不同的RFS率，其中TIME-NK或TIME-Teff患者复发风险最低，而TIME-Treg或TIME-Mye患者RFS降低：

病理反应率（PRR）被确定为与RFS显著相关的临床因素，这与先前研究一致：

T细胞扩增特征与RFS的关联：

对所有患者进行的单变量Cox回归分析显示，扩增CCR8+ Treg克隆型数量和所有Tregs中CCR8+ Tregs的比例与RFS显著相关：

其中，Tex相关细胞中Texp细胞的比例是与RFS最显著相关的T细胞扩增特征（每增加10% Texp比例，风险比HR为0.49）：

Tex细胞比例的预测能力（AUC 0.701）与PRR相似（AUC 0.686），且多变量分析证实Texp比例和PRR与RFS独立相关：

对外部数据集的重新分析也支持了Texp特征与生存或无复发状态的相关性：

Texp比例在非MPR患者中的预测价值：

针对具有较高复发风险的非MPR患者群体，研究进一步分析发现，在Treghi和Treglow非MPR患者中，Tex相关细胞中Texp细胞的比例仍然是与RFS显著相关的预测因素，而PRR在此亚群中不再具有显著预测价值:

Kaplan-Meier曲线分析也证实，在Treghi和Treglow非MPR患者中，Tex相关细胞中Texp细胞比例越高，复发风险越低:

Texp比例对非MPR患者的风险分层能力：

使用所有非MPR患者中Tex相关细胞中Texp细胞比例的中位数作为阈值，可以将非MPR患者分为复发风险显著降低的亚群（与MPR患者相似）和高风险亚群:

在所有非MPR患者中，Tex相关细胞中Texp细胞的比例（AUC 0.736）在预测复发方面优于PRR（AUC 0.59）。这些数据表明，Tex相关细胞中Texp细胞的比例可以有效区分复发风险不同的非MPR患者，并且预测准确性高于PRR:

讨论

新辅助治疗面临的挑战与研究背景

讨论首先指出，虽然新辅助免疫治疗联合化疗是局部晚期NSCLC的优选方案，但患者反应差异大，约40%患者未能达到MPR，且非MPR患者的预后和内部异质性不清楚。

目前的病理反应率（PRR）不足以准确识别不会复发的非MPR患者，因此需要深入理解肿瘤免疫微环境（TIME）的异质性，以改善患者分层和治疗管理。

本研究对TIME异质性的贡献（亚型鉴定）

研究通过鉴定五种具有不同免疫细胞亚群组成和反应率的TIME亚型，扩展了对反应变异背后TIME异质性的理解。特别强调了TIME-NK亚型的高MPR率与FGFBP2+ NK/NK样T细胞的富集相关，这可能与这些细胞对化疗敏感性有关，并与仅接受化疗即获MPR的患者特征一致。

此外，研究在真实世界患者中证实了CCR8+ Tregs与MPR率降低的相关性，支持了其免疫抑制作用及作为治疗靶点的潜力。

非MPR患者内部的T细胞扩增异质性

研究进一步揭示了非MPR患者群体并非同质，而是存在T细胞扩增模式上的异质性，特别是调节性T细胞和Tex相关细胞的差异扩增，由此将非MPR患者细分为Treghi和Treglow亚型。这一发现提示不同非MPR亚型可能需要结合抗PD-1采用差异化的治疗策略。

Texp细胞比例作为RFS预测标志物的价值

最重要的是，研究发现Tex相关细胞中Texp细胞的比例是预测非MPR患者复发风险的更好指标，其预测能力优于PRR。

由于术后复发主要源于微转移且PRR无法准确识别高风险非MPR患者，而Texp细胞特征反映了能够扩增并靶向恶性细胞的免疫细胞状态，因此它可能更好地预测免疫系统清除微转移的能力。

这项研究提供了一个有价值的免疫特征，有助于在新辅助化疗免疫治疗后更精准地对非MPR NSCLC患者进行风险分层，指导后续辅助治疗和临床管理决策。