16S18S_分析步骤（2）

1.概述

步骤1：收集环境样本

• 操作：从环境中收集样本，这些样本可能包括土壤、水体、空气、人体微生物群等。
• 目的：获取包含目标微生物的样本，以便进行后续的DNA提取和分析。

步骤2：从环境样本中提取DNA

• 操作：使用化学和/或物理方法从收集的样本中提取总DNA。
• 目的：获取纯净的DNA，以便进行PCR扩增和测序。

步骤3：扩增DNA标记

• 操作：使用特定的引物对16S rRNA基因的V3和V4区域进行PCR扩增。
• 目的：增加目标DNA片段的数量，使其达到高通量测序所需的浓度。

步骤4：高通量测序

• 操作：利用高通量测序技术（如Illumina平台）对扩增的DNA片段进行测序。
• 目的：生成大量的DNA序列数据，用于后续的生物信息学分析。

数据处理和分析

• 操作：使用生物信息学工具对测序数据进行处理、质量控制和分析。
• 目的：从原始测序数据中提取有用的信息，如OTU（操作分类单元）的分类和多样性。

后续分析

• OTU聚类：将相似的序列聚类为OTUs，每个OTU代表一个微生物物种或分类单元。
• OTU分类：使用数据库（如RDP、SILVA、FunGene）对OTUs进行分类，确定其分类地位。
• 多样性分析：计算α多样性（样本内多样性）和β多样性（样本间多样性），评估微生物群落的多样性和结构。

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文库构建

1. DNA提取：

   • 首先从环境样本中提取总DNA，这可能包括土壤、水体、空气或人体样本等。

2. 设计和使用通用引物：

   • 设计包含V3和V4区域特异性序列的通用引物，这些引物能够识别并结合大多数细菌的16S rRNA基因的这些区域。

3. PCR扩增：

   • 使用设计的通用引物对提取的DNA进行PCR扩增，以增加V3和V4区域的拷贝数，为后续的测序准备足够的模板。

4. 纯化扩增产物：

   • 扩增结束后，需要对PCR产物进行纯化，以去除未结合的引物、dNTPs和其他PCR副产物，确保后续步骤的准确性。

5. 加入接头和Index信息：

   • 在纯化后的扩增子两端加入测序接头（adapters），这些接头包含了测序平台所需的序列信息，如Illumina平台的P5和P7接头。
   • 同时，加入Index信息，这些是独特的序列标签（如Index1和Index2），用于区分不同样本或不同实验条件下的DNA片段。

6. 第二轮PCR：

   • 通过第二轮PCR将接头和Index信息固定到扩增子片段上。这一步确保了每个扩增子都携带了必要的测序信息和样本标识。

7. 文库构建完成：

   • 第二轮PCR结束后，得到的DNA片段即为构建好的测序文库，可以直接用于高通量测序。

8. 文库质量检查：

   • 在测序前，通常需要对构建好的文库进行质量检查，如使用琼脂糖凝胶电泳评估文库的浓度和大小分布，或使用生物分析仪进行更精确的质量评估。

9. 测序：

   • 将质量合格的文库上机测序，获取大量的16S rRNA基因序列数据。

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fastq数据

第一行：序列标识符（ID）

• 格式：以 “@” 开头，后跟一串字符，表示该条序列的唯一标识符。
• 内容：这串字符通常包含了关于序列的来源、样本信息、测序平台等元数据。
• 特点：在同一份FASTQ文件中，每个序列的标识符都是唯一的，即使在不同的文件中也不会重复。

第二行：碱基序列

• 格式：由A、C、G、T和N五个字符组成，表示DNA序列。
• 内容：这一行包含了实际的DNA序列信息，其中：
  • A、C、G、T：分别代表腺嘌呤（Adenine）、胞嘧啶（Cytosine）、鸟嘌呤（Guanine）和胸腺嘧啶（Thymine）。
  • N：代表无法识别的碱基，可能是由于测序过程中的不确定性或错误。
• 特点：这一行是FASTQ文件的核心，包含了实际的生物学信息。

第三行：分隔符

• 格式：以 “+” 开头，后跟一个空格或直接结束。
• 内容：这一行在现代FASTQ文件中通常为空，用于分隔序列信息和质量分数。
• 历史背景：在早期的FASTQ格式中，这一行可能包含与第一行相同的序列标识符，用于验证序列信息的完整性。但在现代应用中，这一行通常被省略，以节省存储空间。

第四行：质量分数

• 格式：由一系列数字组成，每个数字对应第二行中的一个碱基。
• 内容：这一行描述了每个碱基的测序质量，通常使用Phred质量分数表示。
  • Phred质量分数：是一种对碱基测序质量的量化表示，分数越高，表示碱基识别的准确性越高。Phred分数通常转换为ASCII字符表示，以便于存储和处理。
• 特点：质量分数对于后续的数据分析至关重要，如序列比对、变异检测等，因为它们提供了关于数据可靠性的重要信息。

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原始测序数据处理

原始测序数据处理

1. 根据测序barcode（index）序列区分不同的样本序列

• 操作：在测序过程中，每个样本的DNA片段都会附加上一个独特的barcode序列，这个序列作为样本的标签。
• 目的：通过识别这些barcode序列，可以将原始测序数据中混合的序列拆分到对应的样本中，实现样本的区分。

2. 去除接头序列，过滤低质量序列

• 操作：原始测序数据通常包含接头序列和低质量的序列。
  • 去除接头序列：接头序列是PCR过程中添加的，用于测序的识别和结合，需要在数据分析前去除。
  • 过滤低质量序列：低质量序列可能包含较多的测序错误，影响后续分析的准确性，需要被过滤掉。
• 目的：确保后续分析的数据质量，提高分析结果的可靠性。

3. 双端测序序列的拼接

• 操作：对于双端测序（paired-end sequencing）的数据，需要将两端的序列通过序列之间的overlap（重叠区域）拼接成单条序列（Tags）。
• 工具：此步骤通常由专门的软件如flash完成。
• 目的：拼接后的序列更长，包含的信息更丰富，有助于提高物种鉴定的准确性。
  序列1（来自片段的一端）：
  ATCGTACGTAGCTAGCTAGCTACGTAGCTACG
  序列2（来自片段的另一端）：
  TAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTACGTAGCTAG
  步骤1：识别重叠区域
  我们首先需要找到这两个序列之间的重叠部分。在这个例子中，重叠区域是“TAGCTAGCTAGCTA”，长度为12bp（碱基 对）。
  步骤2：序列拼接
  接下来，我们将两个序列通过重叠区域拼接起来。由于两个序列是直接连续的，我们可以直接将序列1与序列2的剩余部分连接起来：
  拼接后的序列：
  ATCGTACGTAGCTAGCTAGCTACGTAGCTAGTAGCTAGCTAGCTACGTAGCTAG
  这里，我们从序列1的开始到重叠区域结束，然后紧接着序列2的重叠区域之后的剩余部分。

4. 去除嵌合体序列

• 操作：嵌合体序列是指由两个或多个不同来源的DNA片段错误拼接而成的序列。
• 目的：嵌合体序列不是真实的生物序列，去除这些序列可以避免对微生物多样性分析结果产生误导。

嵌合体

嵌合体的形成

• 形成过程：

  • 在图示中，DNA聚合酶开始时在Template 1上合成新的DNA链（绿色部分），然后可能由于模板DNA的退火不完全或引物的非特异性结合，聚合酶从Template 1上脱离并切换到Template 2上继续延伸（红色部分）。
  • 这种在不同模板之间切换的延伸过程导致了一个嵌合体DNA分子的产生，这个分子包含了来自两个不同模板的DNA序列片段。

• 结果：

  • 嵌合体DNA分子（Crossover Product）在图中用不同颜色表示，显示了它是由两个不同模板的DNA片段拼接而成的。