微流控工程普鲁士蓝水凝胶微球用于增强骨关节炎抗氧化效应

近年来，研究发现过量的活性氧（ROS）在 OA 发病中起着关键作用，它会加剧细胞外基质降解和软骨细胞凋亡，因此清除 ROS 成为一种具有潜力的干预策略。​

天然抗氧化剂虽表现出一定的 ROS 清除能力，但存在稳定性差、生物利用度低等问题。纳米尺度的递送系统虽能改善这些不足，却面临着关节内滞留时间短、易被快速清除的挑战，可能需要反复注射，增加了不良反应的风险。

水凝胶作为一种三维聚合物网络结构，具有良好的生物相容性、生物降解性和缓释能力，其中水凝胶微球因具有低侵袭性、高比表面积和精确的尺寸控制等特点，被认为是关节内应用的理想形式。然而，以往的 ROS 清除水凝胶微球多作为纳米颗粒的载体，存在载药量低、稳定性不佳以及可能出现不受控的突释等问题。​

普鲁士蓝（PB）作为一种经批准的生物安全材料，具有类似超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的多酶催化活性，在清除 ROS 方面表现出良好的潜力。本研究创新性地通过微流控技术将 PB 纳米酶与藻酸盐 - 透明质酸（AlgHA）水凝胶微球结合，构建了可注射的 AlgHA@PB 平台，旨在实现 ROS 清除和氧气生成的双重效应，同时借助水凝胶微球的结构实现关节内的持续滞留和机械相容性，为 OA 的抗氧化干预提供新的思路。​

其中，AbMole 公司提供的 Span 80 纯度高，在实验中作为乳化剂能有效稳定油相，为微流控系统中液滴的形成提供了可靠保障。​

PB 纳米酶的合成过程如下：将 PVP 粉末溶解在 4mL 去离子水中，配制成 10mg/mL 的溶液。制备 1mL 具有预定 Fe³⁺浓度的 K₃[Fe (CN)₆] 水溶液，并加入到 PVP 溶液中，在室温下搅拌 30 分钟。随后，将 1mL 具有相应 Fe²⁺浓度的 FeCl₂水溶液逐滴加入到搅拌的溶液中，溶液立即变为蓝色，表明 PB 纳米颗粒的形成。所得悬浮液使用截留分子量为 100kDa 的 Amicon Ultra-15 离心过滤器进行多次离心和洗涤。​

采用微流控方法制备 AlgHA@PB 时，将 Alg 和 HA 以 1:1 的比例溶解在去离子水（DIW）中，形成 2wt% 的聚合物溶液（AlgHA），然后与 8wt% 的 EDTA-Fe³⁺混合作为分散相。连续相采用含有 5wt% Span 80 的花生油。通过微流控系统将分散相引入连续相，优化流速比以产生均匀的液滴。液滴在收集浴中固化形成 AlgHA/Fe³⁺微球。之后，用己烷和 DIW 交替洗涤微球以去除残留的油，然后用含有 1wt% 亚铁氰化钾（K₄[Fe (CN)₆]）的溶液处理，使 PB 在铁交联点形成，最后用 1wt% 的 CaCl₂溶液稳定交联，得到适合应用的均匀 AlgHA@PB 微球。将 PB 和 AlgHA@PB 冷冻干燥后储存，用于后续实验。​

通过 UV2600 分光光度计分析确认 PB 和 AlgHA@PB 的成功构建。此外，在微球完全溶解于 EDTA 溶液后，对 AlgHA@PB 中的 PB 含量进行定量测量。在显微镜下观察 AlgHA@PB 的图像，并使用 ImageJ 测量 100 个随机选择的微球的平均直径。冷冻干燥后，通过扫描电子显微镜（SEM）确定 AlgHA@PB 的结构和元素分布，通过透射电子显微镜（TEM）对 PB 进行形态分析，使用傅里叶变换红外光谱仪确定微球的化学结构，通过专业测试机构配备的摩擦学测量仪器评估 PB 和 AlgHA@PB 的摩擦系数（COF），并使用 1mL 胰岛素注射器评估 PB 和 AlgHA@PB 的可注射性。​

细胞培养方面，小鼠胚胎成纤维细胞 NIH3T3，小鼠胚胎肿瘤细胞 ATDC5，人软骨细胞系 C28/I2 这些细胞在添加 10% FBS 的 DMEM 中，在 5% CO₂、37℃的标准条件下培养。​

抗氧化能力评估实验中，将不同量的 AlgHA@PB（0、10、25、50、100mg/mL）与 1M H₂O₂溶液混合，在 37℃下反应指定时间。在指定时间点（0.5、1、2、4、8 小时），从混合物中取出 100μL 样品，使用 H₂O₂测定试剂盒定量剩余的 H₂O₂浓度，并监测氧气气泡的形成以评估 AlgHA@PB 将 H₂O₂转化为 O₂的催化能力。​

细胞毒性实验按照 ISO/EN 10993-5 指南进行评估。将 DMEM 与不同量的 AlgHA@PB（0、10、25、50、100mg/mL）在 37℃下孵育 24 小时，制备提取培养基。将 NIH3T3 以 1×10⁴个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37℃下培养 24 小时。24 小时后，更换培养基，将细胞与提取培养基进一步培养 24 小时，使用 CCK-8 测定试剂盒（AbMole）评估细胞毒性。​

活死细胞染色实验中，将 NIH3T3 以 5×10³ 个细胞 / 孔的密度接种到 24 孔板中，加入 1mL 含有 10% FBS 的 DMEM 培养基，在 37℃、5% CO₂培养箱中过夜孵育。24 小时后，更换培养基，实验组加入 AlgHA@PB（100mg/mL），对照组不做处理，分别培养 1、2、3 天。每个时间点后，使用活死染色试剂盒（AbMole）对细胞进行染色，在荧光显微镜下观察并成像。​

细胞增殖实验中，将对数生长期的 NIH3T3 以 2×10³ 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，加入 200μL 含有 10% FBS 的 DMEM 培养基，在 37℃、CO₂培养箱中孵育 24 小时。移除原培养基后，实验组加入 200μL AlgHA@PB（100mg/mL）提取物，对照组加入 200μL DMEM 培养基，再孵育 24 小时。在处理后 1、2、3 天使用 CCK-8 测定法评估细胞增殖，每次测量后，用 PBS 洗涤细胞，更换含有相同浓度 AlgHA@PB 的新鲜 DMEM，在每个时间点重复测定。​

将 ATDC5 以 5×10³ 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，与不同浓度的 H₂O₂（0、10、25、50、100μM）和 AlgHA@PB 共孵育 24 小时，随后使用 CCK-8 测定法测量各组细胞活力，并用酶标仪在 450nm 处测量上清液的吸光度，评估 AlgHA@PB 对软骨细胞的保护作用。​

体外抗氧化功能验证实验中，将 ATDC5 以 2×10⁴个细胞 / 孔的密度接种到 24 孔板中，与终浓度为 100μM 的 H₂O₂共孵育 24 小时。实验组在培养基中加入相同体积的 PB 和 AlgHA@PB 与细胞共培养，对照组的 ATDC5（密度为 2×10⁴个细胞 / 孔）也与终浓度为 100μM 的 H₂O₂共孵育或不孵育。孵育 12 小时后，向所有实验组加入 10μM 的 ROS 检测探针 DCFH-DA，在 37℃下孵育 6 小时后，使用荧光显微镜观察所有实验组的细胞内 ROS 水平。​

采用 Ru (dpp)₃Cl₂评估 PB 和 AlgHA@PB 在细胞内的氧气生成情况，在上述实验条件下，向各组加入 10μg/mL 的 Ru (dpp)₃Cl₂，37℃孵育 6 小时后，用荧光显微镜定量所有实验组的 O₂水平。​

体外抗炎功能验证实验中，将 ATDC5 以 1×10⁴个细胞 / 孔的密度接种到 24 孔板中，孵育至细胞贴壁。向培养基中加入终浓度为 10ng/mL 的 IL-1β 以诱导类骨关节炎炎症，随后分别将 100mg/mL 的 AlgHA@PB 和 PB 与细胞共孵育 24 小时，通过免疫荧光染色检测 II 型胶原（COL2）和基质金属蛋白酶 13（MMP13）的表达。此外，在 C28/I2 细胞上重复相同的处理方案，通过 ELISA 检测 IL-6 和 TNF-α 的表达来评估抗炎效果。​

体内实验选用 6 周龄雌性 Sprague-Dawley 大鼠（体重 180-200g），适应 1 周后使用。在异氟烷麻醉下，通过 30G 针头向右膝关节单次关节内注射 3mg MIA（溶于生理盐水，体积 30μL）构建 OA 模型。将大鼠分为假手术组、PB 组、AlgHA@PB 组和未处理的对照组，处理组每周给予 100mg/mL 的 PB 或 AlgHA@PB，分别在处理 2 次和 4 次后进行组间比较。​

溶血实验评估 AlgHA@PB 的血液相容性：取 500μL 大鼠血液，4℃下 2000rpm 离心 10 分钟分离红细胞，用 PBS 洗涤三次后重悬于相同缓冲液中。将 100μL 100μg/mL 的 AlgHA@PB 和 PB 分别与 900μL 红细胞悬液混合，37℃孵育 2 小时，以去离子水和 PBS 分别作为阳性和阴性对照。孵育后，2000rpm 离心 10 分钟，用酶标仪在 545nm 处测量上清液的吸光度。​

在 naive 大鼠双侧关节内注射：一侧膝关节注射 30μL 100mg/mL 的 AlgHA@PB，对侧注射等量的 PB 纳米颗粒，在注射后 1、3、5、7 天收获关节，宏观评估材料滞留情况。​

大鼠处死后，取出膝关节并固定在 4% 多聚甲醛中，使用 X 射线系统成像，同时采用高分辨率微计算机断层扫描评估膝关节，并用 CTVox 软件重建三维（3D）模型。​

所有大鼠关节均进行 H&E 染色和番红 O - 固绿染色以进行组织病理学评估，并通过免疫组织化学分析各组的 II 型胶原含量。

收集大鼠血液样本，分离血清，使用 ELISA 试剂盒测定 TNF-α、IL-6、IL-10 和 IL-4 的浓度。全血通过眼眶取血，4℃静置 12 小时后，1000×g 离心 15 分钟分离血清，立即储存在 - 80℃直至分析。​

PB 和 AlgHA@PB 的表征结果显示，通过微流控芯片分割得到均匀粒径的黄色水凝胶微球，交联后形成蓝色的 AlgHA@PB，过程中微球变得更致密，主要粒径从 230nm 减小到 175nm，较小的直径使其能通过注射器有效注射。SEM 观察发现，AlgHA/Fe³⁺的横截面表面光滑，而 AlgHA@PB 的结构包含许多类似 PB 的特征，元素映射证实 Fe 和 Ca 元素分布均匀。UV - 可见光谱显示 PB 和 AlgHA@PB 在 700nm 处的特征峰相似，定量分析证实 1mg AlgHA@PB 中普鲁士蓝（PB）的含量为 2.45±1μg。

FTIR 分析显示，PB 的特征峰为 2062cm⁻¹ 处的 C=N 伸缩振动和 492cm⁻¹ 处的 Fe-C≡N 伸缩振动，AlgHA@PB 也具有相同的峰，表明其与 PB 结构一致。摩擦系数（COF）是关节内应用的重要评估标准，PB 组在最初 3 分钟内 COF 稳步上升超过 0.04，无法维持稳定的润滑层，而 AlgHA@PB 组 COF 稳定在 0.03 以下，与 PB 组相比摩擦减少约 40%，上述结果证实了 AlgHA@PB 的成功构建，其基质中包含 PB 结构。​

抗氧化酶活性评估显示，AlgHA@PB 与过氧化氢（H₂O₂）反应的能力与水凝胶微球的浓度和反应时间均呈正相关，不同浓度和反应时间下的 H₂O₂清除效率为后续实验提供了参考。与等体积的 PB 相比，AlgHA@PB 与 1M H₂O₂反应时，在 10 分钟时反应速率最快，产生大量气泡，这可能归因于其与溶液的接触面积更大以及抗氧化结构单元含量更高。此外，AlgHA@PB 表现出超氧化物歧化酶（SOD）酶活性，且反应速率随浓度增加而加快。​

细胞毒性和保护作用实验中，CCK-8 实验表明 NIH3T3 细胞与不同浓度的 AlgHA@PB 共培养 24 小时后，细胞活力保持一致，表明 AlgHA@PB 无细胞毒性。活死染色显示，对照组和 AlgHA@PB 组在 1、2、3 天的死细胞极少，大多数活细胞随时间保持稳定活力，活细胞定量评估证实培养期间细胞密度逐渐增加，且 AlgHA@PB 组细胞活力更优。CCK8 测定结果显示，共孵育 1、2、3 天后，AlgHA@PB 促进细胞增殖（p<0.001）。

随着 H₂O₂浓度升高，NIH3T3 细胞活性逐渐下降，在 50μM 时降至 < 50%，而添加 AlgHA@PB 后，在不同 H₂O₂浓度下均能提高细胞活性，在 50μM 时活性仍接近 70%（p<0.01），表明其通过分解 H₂O₂发挥保护作用。综上，微流控装置制备的 AlgHA@PB 具有优异的生物安全性，能保护细胞免受 ROS 损伤并促进细胞增殖，具有体内应用潜力。​

体外抗氧化效果实验中，10ng/mL 的 H₂O₂模拟炎症微环境诱导软骨细胞氧化应激，H₂O₂诱导 12 小时后 ROS 水平显著升高，而加入 PB 和 AlgHA@PB 后，荧光强度较 H₂O₂组明显降低，差异具有统计学意义（p<0.001）。在相同 PB 浓度下，PB 组因纳米颗粒聚集导致清除效率降低，而 AlgHA@PB 的结构稳定缓解了这一问题，即使在高浓度下仍能保持功能性能。

细胞内氧气生成实验中，荧光分析证实 PB 和 AlgHA@PB 能产生足够的 O₂以淬灭 [Ru (dpp)₃] Cl₂信号（p<0.01）。空白 AlgHA 微球的生物活性评估显示其在氧化还原调节中呈生物惰性，排除了材料本身作为自变量对治疗效果评估的影响。这些结果有力地支持了 PB 和 AlgHA@PB 的功能，突出了 PB 整合到水凝胶微球后的抗氧化活性，且水凝胶微球结构可避免纳米颗粒类似的聚集，更适合化学催化结构发挥作用。​

体外抗炎机制实验中，II 型胶原（COL2）和基质金属蛋白酶 13（MMP13）是 OA 发病机制中的关键蛋白，OA 中 COL2 表达降低导致软骨基质进行性降解、软骨变性和关节功能丧失，而 MMP13 表达显著升高与软骨破坏和关节损伤密切相关。免疫荧光图像显示，IL-1β 组 COL2 荧光强度降低，而 PB 和 AlgHA@PB 组强度升高（p<0.001）；MMP13 在 IL-1β 组高表达，经 PB 和 AlgHA@PB 处理后显著降低（p<0.0001）。IL-1β 诱导的炎症细胞经 PB 或 AlgHA@PB 处理后，COL2 表达增加 20 倍，MMP13 表达降低 11 倍。

C28/I2 细胞中各组促炎细胞因子水平检测也得到类似结果，表明 AlgHA@PB 和 PB 可通过调节软骨基质成分的合成和降解相关酶，抑制细胞外基质降解并减轻 OA 的炎症反应。​

体内 OA 相关实验中，溶血实验显示 AlgHA@PB 的溶血率接近 1%，表明其是安全的材料。关节腔内容物评估显示，PB 在 3 天内几乎完全清除，而 AlgHA@PB 部分降解但仍滞留于关节腔内，这使其能获得更好的效果并减少 OA 大鼠的处理次数，且除对照组大鼠体重在处理过程中略有受影响外，其他处理对体重无显著影响。X 射线和 micro-CT 作为评估 OA 干预效果的可靠指标，14 天时对照组开始出现 OA 早期症状，如骨密度降低、软骨侵蚀等，PB 组和 AlgHA@PB 组效果相似；28 天时对照组骨破坏严重，关节软骨结构基本消失，而 AlgHA@PB 仍保持较好的关节软骨表面，PB 组则因在关节腔内清除后炎症持续较长时间，关节破坏程度显著。这些结果验证了模型构建成功，并凸显了 AlgHA@PB 增强且持久的抗氧化效果。​

组织学染色和细胞因子检测显示，14 天和 28 天结果存在显著差异。14 天时，假手术组关节软骨表面完整，蛋白聚糖含量高，呈鲜红色；对照组出现明显 OA 症状，关节软骨表面受损，基质破坏，模型构建成功；PB 组关节软骨基质轻度降解，骨连续性中断，AlgHA@PB 仅轻微褪色，整体状况接近假手术组。在滑膜炎症和胶原表达方面也得到类似结果，PB 和 AlgHA@PB 组均显示出一定程度的滑膜修复，COL2 表达与假手术组相当。OARSI 评分分析显示，在 OA 的短期干预中，PB 和 AlgHA@PB 均表现出相当的软骨保护效果。关节内注射 PB 或 AlgHA@PB 的抗氧化处理能降低 OA 大鼠 IL-6 和 TNF-α 等促炎细胞因子的相对水平，增加 IL-10 和 IL-4 等抗炎细胞因子的水平。

随着时间延长，关节内注射 AlgHA@PB 的优势进一步体现，28 天时，假手术组关节软骨一侧蛋白聚糖略有减少，可能是大鼠衰老的正常现象；对照组从 14 天起关节损伤进一步加重，关节软骨结构几乎消失；PB 组结果与对照组相似，可能与 PB 在关节腔内滞留时间短及处理周期有关；AlgHA@PB 组关节软骨表面虽略有不平整，但情况良好。滑膜组织观察也得出一致结论，PB 组滑膜炎症与对照组更接近，而 AlgHA@PB 组逐渐恢复，与假手术组相似。血清细胞因子分析显示，长期处理后，PB 和 AlgHA@PB 组促炎细胞因子浓度均降低，抗炎细胞因子浓度均升高，但两组差异逐渐扩大，尤其是在对软骨修复至关重要的 IL-10 和 IL-4 水平上。

上述结果进一步凸显了 AlgHA@PB 在 OA 长期干预中持续抗氧化的优势，且 AlgHA@PB 的 COL2 表达与假手术组相似，证实其通过抗氧化发挥良好的软骨保护作用。OARSI 评分分析表明，在 OA 长期管理中，AlgHA@PB 的干预潜力优于单独使用 PB。​

综上所述，本研究构建的创新性集成自抗氧化普鲁士蓝水凝胶微球（AlgHA@PB），结合了普鲁士蓝高效的抗氧化性能和水凝胶微球的结构优势，实现了显著的 ROS 清除效果和延长的关节滞留时间，在 OA 干预中表现出优异的效果。