DNA与蛋白相互作用检测技术ChIP-qPCR

DNA与蛋白质作为生命活动的核心分子，DNA不仅承载遗传信息，更通过与蛋白质的动态互作调控基因表达、维持染色质结构，并在疾病发生发展中起关键作用。二者的功能异常常导致疾病发生，因此解析其相互作用机制对揭示疾病本质具有重要意义。为助力科研突破，伯远生物提供高效的蛋白与DNA、蛋白与RNA、蛋白与蛋白互作研究解决方案（详见【业务介绍】蛋白互作技术大全）

其中染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的“黄金标准”，通过特异性抗体免疫共沉淀目的蛋白和与其互作结合的DNA区段。利用ChIP，我们能精准定位基因组特定区域的组蛋白修饰或转录因子结合情况，为表观遗传学和基因调控研究提供核心数据。在ChIP-seq分析后，一般常需对筛选出的靶基因进行结合验证。此时，ChIP-qPCR凭借其体内富集优势（相比体外实验，ChIP-qPCR体内富集能够更真实地反映结合状态的特性）成为首选方法。目前ChIP定量主要采用两种策略：

双标准曲线法： 需同时绘制目的基因和看家基因的标准曲线，若标准品与待测样品性质差异较大，可能引入扩增效率误差；

双ΔCT法： 通过做校正，避免标准曲线偏差，现已成为主流分析方案。

一、ChIP-qPCR实验流程

（一）ChIP免疫共沉淀富集DNA

1、实验材料的交联处理：甲醛交联将DNA结合蛋白和DNA紧密固定；

2、实验材料的染色质抽提；

3、染色质的超声波片段化：通过超声破碎将交联后的染色质打断成小片段，片段范围在200-700bp左右；

4、染色质前处理和免疫共沉淀：利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。Protein A/G磁珠拉取抗体-蛋白-DNA复合物；

5、洗脱蛋白质-DNA复合物；

6、纯化 DNA。

图 ChIP-seq /qPCR流程图。

（二）引物设计

1、潜在靶点选择

（1）基于前期测序结果：若已有ChIP-seq数据，可直接针对预测的motif关联peak区域设计引物，或通过IGV等可视化工具精确定位peak核心区序列；

（2）借助公共数据库：若无测序数据，可检索Cistrome DB等ChIP数据库，参考同类研究中目标蛋白的结合位点信息进行验证性设计；

（3）利用保守性生信预测：对于人、小鼠等常规模型物种，还可通过Jaspar等数据库预测转录因子结合位点，并在靶基因序列中筛选潜在互作区域。

2、引物设计建议

一般ChIP-qPCR的引物长度不宜过长，扩增片段大小需在200bp以内。引物设计时与普通荧光定量引物设计原理一致（可使用引物设计软件或常用网站，注意区分cDNA和genomic DNA），需满足多项常规原则，包括引物长度、Tm退火温度及GC含量等关键参数。

Tips：

（1）ChIP-qPCR引物设计直接影响实验的灵敏度和特异性，建议在设计完后对引物的特异性进行验证后使用，有效避免非特异性扩增对实验数据的干扰。

（2）ChIPprimersDB数据库网站收录了部分ChIP经过验证的qPCR引物可供参考。

（3）如果需特定序列位置的引物设计，您也可提供详细序列信息委托我们完成。

（三）qPCR及数据分析

1、PCR 反应

对每个样本（单个样本通常做3个技术重复）的Input、IP、IgG-DNA进行qPCR实验，统计每个复孔的CT值（即荧光信号达到设定阈值时的循环数），随后利用2-ΔΔ CT法进行富集倍率的计算。2-ΔΔ CT法是一种基于实时荧光定量PCR循环阈值的标准化方法。该方法首先通过Input对照（片段化并解交联的纯化DNA，用于消除样本背景差异）对免疫沉淀（IP）产物进行均一化处理，得到ΔCT（IP CT值 - Input CT值）；同时，阴性对照抗体IgG的富集产物也需用相同Input进行均一化处理。随后，计算IP与IgG均一化后的CT值差异（ΔΔCT = ΔCT_IP - ΔCT_IgG），最终通过公式2-ΔΔ CT将循环数差异转换为目标位点的富集倍数，从而定量分析特定蛋白质与DNA的结合强度。这一方法通过双重标准化（Input和IgG对照）有效减少了实验系统误差，提高了数据可比性。

2、数据计算

Input通常为总量的1/10，即稀释了10倍，Log2 (Input Dilution Factor)≈3.3

ΔCt [normalized IP] = (Ct [IP] - (Ct [Input] -Log2 (Input Dilution Factor))

Input Dilution Factor（IDF）= (fraction of the Input chromatin saved) -1

ΔΔCt [IP/NIS] = ΔCt [normalized IP] - ΔCt [ IgG ]

Fold Enrichment = 2^ (-ΔΔCt [IP/NIS])

二、ChIP-qPCR技术优势

1、更真实地反映结合状态：能够直接反映细胞内原位的蛋白质-DNA互作状态，相较于EMSA或Dual-LUC等体外实验，其数据更贴近生理真实环境，具有更高的生物学说服力。

2、高灵敏性与特异性：通过抗体特异性富集目标蛋白-DNA复合物，结合qPCR的精准扩增检测，可准确测定特定基因或区域（如启动子、增强子）的结合情况，显著降低假阳性风险。

3、直接定量能力：无需依赖间接信号转换，通过标准曲线直接计算DNA结合位点的拷贝数，提供靶标区域结合的定量化数据（如富集倍数）。

4、靶向分析灵活性：可针对特定基因调控元件（如转录因子结合位点、组蛋白修饰区域）进行定制化检测，支持高分辨率的功能机制研究。

5、多技术联用潜力：可与RNA-seq（验证转录调控效应）、CRISPR编辑（验证功能位点）或ChIP-seq（先导筛选）等技术协同，形成多维研究体系。

三、ChIP-qPCR应用场景

1、转录因子与DNA互作研究：鉴定转录因子在特定基因组位点（如启动子、增强子）的结合情况。

验证已知转录因子是否结合到目标基因的调控区域。

研究转录因子在疾病或刺激条件下的动态结合变化。

2. 组蛋白修饰分析：检测组蛋白修饰（如H3K27ac激活标记、H3K27me3抑制标记）在基因区域的富集程度。

关联修饰与基因表达状态（如高H3K4me3水平常出现在活跃转录的启动子区）。

比较不同细胞类型或发育阶段中修饰模式的差异（如干细胞分化过程中修饰重编程）。

3、疾病机制与生物标志物探索

癌症中异常转录因子结合。

神经退行性疾病中组蛋白修饰异常。

4. 药物开发与表观遗传治疗

确认药物是否通过改变转录因子结合或修饰发挥作用。

定量评估表观遗传药物处理后目标位点的修饰变化。

四、ChIP-qPCR交付内容

1、前期质检WB验证结果；

2、包括实验过程、实验试剂与设备等的详细实验报告；

3、所有实验的原始数据，包含原始下机EDS文件、结果导出文件等；

4、验证所用的靶基因引物序列；

5、相对表达量检测分析结果；

6、结题后剩余的富集DNA（如有剩余可选择返样）。

图 ChIP-qPCR部分结果示例。

五、常见问题

1、什么是Input、IgG样本？

Input样本是实验片段化之后取出来的对照，只是不做后续的IP过程，相当于Input含有样本的所有蛋白和DNA等物质，经纯化后作为计算中的对照样本。而IgG是作为阴性对照样本，理论上不具备特异性结合DNA片段的能力，其CT值在富集过程中可作为阴性参照基线，通过与目标抗体（IP组）的CT值对比计算富集倍率（Fold Enrichment）。当IP组与IgG组的CT值差异越大时，表明目标DNA片段的富集特异性越显著。

2、ChIP-qPCR是否需要做生物学重复？

一般是建议2-3个生物学重复，确保结果可靠性和科学严谨性，复杂样本或高变异情况：可能需要更多重复（如临床样本或异质性组织）。

（1）减少个体差异影响：不同样本（如细胞、动物）之间存在天然变异，生物学重复可评估这种变异对结果的干扰。

（2）提高统计效力：通过重复实验能区分真实信号与随机误差，满足统计分析的基本要求。

（3）大多数期刊和领域的会有要求。

六、案例展示

题目：Thiostrepton induces ferroptosis in pancreatic cancer cells through STAT3/GPX4 signalling.

期刊：Cell death & disease（IF=8.1）

研究背景：铁死亡的关键调控因子谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4，GPX4）通过催化脂质过氧化物转化为无毒的脂质醇，从而有效抑制铁死亡。尽管已报道硫链丝菌肽（Thiostrepton，TST）具有抗肿瘤作用，但其在胰腺癌中的作用及其潜在机制仍不清楚。本研究揭示了TST通过STAT3/GPX4信号通路诱导胰腺癌细胞铁死亡的作用机制。

研究结果：

实验结果表明，TST能显著抑制胰腺癌细胞系的活力与克隆形成能力，同时引发细胞内铁过载、活性氧（ROS）累积、丙二醛（MDA）水平升高以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）耗竭等铁死亡特征性改变。机制研究发现，STAT3可直接结合GPX4启动子区域并激活其转录，而TST通过调控STAT3显著抑制GPX4表达。动物实验进一步证实，TST能有效抑制皮下移植瘤的生长且表现出良好的生物安全性。该研究不仅阐明了TST抗胰腺癌的作用靶点，也为铁死亡相关肿瘤治疗策略提供了新的理论依据。

作者首先使用 JASPAR网站预测了STAT3在GPX4启动子上的潜在结合位点。随后通过 ChIP-qPCR实验来确认这些位点。ChIP实验的结果证实了STAT3可以直接与GPX4的启动子区域（P2）结合，而非其他预测的结合位点（P1、P3 和 P4）。

图 TST 激活STAT3–GPX4信号通路（Zhang et al., 2022）。

E-F：蛋白质印迹和 qRT-PCR分析，胰腺癌中STAT3过表达引起的GPX4表达变化。G-H：JASPAR 预测了一个保守的 STAT3 结合基序，并显示了GPX4启动子中潜在STAT3结合位点的示意图。I：ChIP分析细胞中GPX4启动子上STAT3的占有率。J：在GPX4启动子区含有STAT3结合位点（WT和MUT）的荧光素酶报告质粒的示意图。K：荧光素酶报告基因分析。

小医叨叨

作为表观遗传学研究的关键技术，ChIP-qPCR验证实验对操作规范与经验积累有着极高要求。伯远生物配备专业技术团队，累计为上千课题组提供ChIP富集实验服务，我们的技术团队不仅掌握超声破碎效率优化、抗体特异性验证等核心环节的标准化质控标准，更建立了覆盖植物、动物、微生物的跨物种实验体系。若您正面临染色质免疫共沉淀的验证难题，欢迎通过通过400-027-0273联系我们，期待与您的沟通交流！

参考文献

[1] Zhang W, Gong M, Zhang W, et al. Thiostrepton induces ferroptosis in pancreatic cancer cells through STAT3/GPX4 signalling[J]. Cell death & disease, 2022, 13(7): 630.