25%甘油（灭菌）保存菌液以及10%甘油（普通）保存蛋白的原理及操作-实验操作系列-010

01 甘油保菌实验原理

1. 渗透压调节

甘油作为渗透压调节剂，能显著降低水的结冰温度，防止低温环境中细菌细胞内冰晶的形成。冰晶会破坏细胞膜，从而损伤细胞的完整性。甘油能够减少冰晶的生成，维持细胞结构的稳定，保护细胞免受低温伤害。

2. 抗氧化保护

低温条件下，细菌细胞容易遭受氧化损伤，导致DNA、RNA和蛋白质等分子降解。甘油可以与细胞内部分子发生相互作用，形成保护层，减少氧化损伤，防止细胞成分的降解，保持细胞的稳定性和活性。

3. 提供能量与碳源

在低温环境中，细菌的新陈代谢减缓，能量储备减少。甘油作为有机碳源和能量供应物质，能够为细菌提供所需的营养，维持其活力和存活，确保细菌在低温下依然保持一定的生理活性。

一、实验步骤

1. 实验准备

• 工具准备与灭菌：准备镊子、EP管、移液枪头等工具，并通过高压灭菌锅进行灭菌处理（121℃，持续15-20分钟）。灭菌后，将工具放置在无菌操作台上待用。

2. 甘油保存液配制

• 甘油保存液制备：根据实验需求，将甘油稀释至适宜浓度（如50%）。具体操作是将等体积的甘油与蒸馏水混合，逐滴加入甘油，轻轻搅拌以避免泡沫产生。最终得到的50%甘油水溶液需在无菌条件下保存，备用。这一步和上面一样，高压灭菌，但是瓶口不能拧紧防止爆炸！！！

3. 菌种培养

• 菌种接种与培养：将待保存的菌种接种至液体培养基中进行培养。对于一般细菌使用普通肉汤培养基，而对于要求较高的菌株（如链球菌、奈瑟氏菌）则使用专用培养基。根据菌种特性，选择合适的培养条件，确保菌种达到适宜的生长浓度。

4. 甘油保存液与菌液混合

• 混合甘油保存液与菌液：待菌液培养至适当浓度后，按照比例（如1:1）将甘油保存液与菌液混合。混合时需摇匀或轻轻吹打，确保甘油均匀包裹细菌细胞，提供有效的保护。

5. 分装与保存

• 分装与标记：将混合好的甘油菌液分装至EP管中（如500μL或1mL），并在EP管上标注菌种名称、保存日期、稀释比例等信息，方便后续管理。

• 保存条件：将分装好的EP管放入超低温冰箱中保存，依据菌种特性选择适宜保存温度（如-20℃、-70℃或-80℃），以有效抑制细菌代谢，延长保存时间。

02 蛋白质保存中甘油浓度的选择

甘油在蛋白质保存中的主要作用是作为冷冻保护剂，它能够保护蛋白质在低温条件下保持稳定性。选择合适的甘油浓度至关重要，以下是保存蛋白时常用的甘油浓度及其相关原因：

1. 常用甘油浓度

• 10%-20%甘油：这是一种常见的保存浓度，适用于短期存储蛋白质（通常用于-20°C保存）。这个浓度足以在常规冷冻保存过程中防止蛋白质聚集或析出，同时保持良好的稳定性。

• 50%甘油：对于需要长期保存的蛋白质，通常会使用50%甘油溶液。这种浓度可以有效避免低温下冰晶形成，减少蛋白质损伤，适合用于-80°C或超低温环境中长期保存。

2. 甘油的保护作用

• 防止冰晶形成：甘油通过降低水的冰点，防止在低温下形成冰晶，从而减少对蛋白质的物理损伤。

• 保护蛋白质结构：甘油能够与蛋白质相互作用，形成保护层，防止蛋白质在冷冻过程中发生变性或聚集。

• 维持蛋白质活性：适当浓度的甘油可以有效维持蛋白质的结构和功能，确保其在复溶后仍然具备活性。

一、蛋白质保存的基本步骤

1. 实验准备

• 工具准备与灭菌：准备离心管、移液枪头等工具，所有器具需进行高压灭菌处理，确保无菌环境。

2. 甘油保存液配制

• 根据需要选择合适的甘油浓度（如10%-50%），将甘油和蒸馏水按比例混合，确保溶解均匀。混合过程中避免泡沫的产生。这里的甘油不用灭菌处理！！！

3. 蛋白质与甘油溶液混合

• 将待保存的蛋白质与甘油保存液按照适当比例混合。混合时轻轻摇匀或使用移液枪，确保甘油均匀分布于蛋白质溶液中。

4. 分装与保存

• 将混合好的蛋白质溶液分装至离心管中，并在管上标明蛋白质名称、保存日期及甘油浓度等信息。采用液氮速冻之后保存，保存时应选择适当的低温环境（-20°C或-80°C）以确保蛋白质的稳定性。