Plant Biotechnol J（IF=10.5）|DAP-seq助力揭示葡萄白粉病抗性机制
葡萄（Vitis spp.）是一种在全球范围内广泛种植的重要经济型作物。目前，大多数栽培葡萄属于欧亚种葡萄（Vitis vinifera），该品种对白粉病高度敏感。白粉病可侵染葡萄所有绿色器官，并在整个生长季持续危害，严重降低果实产量和品质。目前主要依赖化学杀菌剂进行防治，成本高昂且会给社会经济和环境带来负面影响。因此，培育抗病品种是一种更可持续的解决方案。鉴定白粉病抗性基因至关重要，可为通过基因工程手段培育抗病品种提供关键靶点。
2025年6月18日，西北农林科技大学园艺学院王西平教授课题组在Plant Biotechnology Journa（IF=10.5）发表了题为“A module with multiple transcription factors positively regulates powdery mildew resistance in grapevine”的研究论文。该研究借助DAP-seq技术揭示了中国野生毛葡萄通过VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1信号模块调控白粉病抗性的分子机制，为葡萄抗病分子育种提供了新的理论基础。
技术路线
研究发现，VqWRKY46是葡萄白粉病正调控因子，借助农杆菌介导的体细胞胚转基因体系，成功获得VqWRKY46过表达株系和干扰株系。接种葡萄白粉菌9 d后，与野生型（WT）相比，过表达植株表现出分生孢子数量减少、菌丝长度缩短，同时伴随胼胝质积累增加、过氧化氢含量升高及HR反应增强等现象，以及防御相关基因的表达水平显著上调；而干扰植株的表型则呈现相反趋势。上述结果证实，VqWRKY46正向调控葡萄对白粉菌的抗性。
图1. VqWRKY46增强葡萄对白粉病的抗性。
为探究VqWRKY46的上游调控机制，该研究通过酵母单杂交（Y1H）文库筛选，鉴定到转录因子VqLIMYB。生物信息学分析显示，VqWRKY46启动子区域存在MYB家族转录因子的典型结合基序（Myb motif: CAGTTA）。Y1H试验证实，VqLIMYB可特异性结合该启动子区域。进一步的凝胶迁移实验（EMSA）表明，VqLIMYB与Myb motif元件的直接互作具有序列特异性。双荧光素酶报告系统（DLR）及GUS活性检测结果显示，VqLIMYB可显著增强VqWRKY46启动子的转录活性。上述结果表明，VqLIMYB通过直接结合VqWRKY46启动子上的Myb motif元件，激活其表达。通过瞬时转化技术获得VqLIMYB过表达和缺失转基因植株（OE-VqLIMYB、RNAi-VqLIMYB），接种白粉菌后的表型分析显示，VqLIMYB过表达显著增强葡萄对白粉病的抗性。
图2. VqLIMYB直接与VqWRKY46启动子的Myb motif（CAGTTA）结合并激活其表达。
为解析VqWRKY46的互作蛋白网络，利用酵母双杂交（Y2H）文库筛选获得转录因子VqNF-YC9。通过Y2H验证、双分子荧光互补（BiFC）、分裂荧光素酶互补（Split-LUC）、Pull-down及荧光共振能量转移（FRET-AB）等试验，证实VqWRKY46与VqNF-YC9存在直接互作。此外还发现，VqWRKY46与VqNF-YC9均可通过自身互作形成同源二聚体。
图3. VqWRKY46与VqNF-YC9存在物理相互作用。
进一步研究表明，VqNF-YC9启动子区域含有3种典型的WRKY结合基序W-box（Wbox1: TTGACC；Wbox2: TTGACT；Wbox3: TTGACA）。通过Y1H、EMSA及DLR试验，证实VqWRKY46可直接结合上述W-box元件并激活VqNF-YC9的转录。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析显示，VqNF-YC9在VqWRKY46过表达株系中的表达量显著高于野生型（WT），而在干扰株系中表达量则呈下调趋势。上述结果表明，VqWRKY46与VqNF-YC9之间存在双重调控关系：既能通过蛋白互作形成功能复合体，又能通过靶向启动子W-box元件调控VqNF-YC9的转录表达，进而构成多层次协同调控网络。通过瞬时转化获得VqNF-YC9过表达和缺失转基因植株（OE-VqNF-YC9、RNAi-VqNF-YC9），接种白粉菌后的表型分析表明，VqNF-YC9过表达可显著增强葡萄对白粉病的抗性。
图4. VqWRKY46特异性结合VqNFYC9启动子中的三个典型的W-box。
为深入鉴定VqWRKY46的直接靶基因，作者采用DNA亲和纯化测序技术（DAP-seq）进行分析，共鉴定到416个重叠结合峰，其中约28%定位于启动子区域。基序富集分析显示，核心顺式元件为典型W-box（TTGACC/T）。重点关注到抗病基因VqDSC1，其启动子区域含有3个Wbox1（TTGACC）和4个NF-YC类转录因子结合位点CCAAT。通过Y1H、EMSA及DLR实验，证实VqWRKY46可特异性结合Wbox1并激活VqDSC1转录；而VqNF-YC9虽无法直接结合CCAAT位点，但与VqWRKY46互作后可显著增强其对VqDSC1启动子的激活作用。RT-qPCR结果显示，VqDSC1在VqWRKY46过表达株系中显著上调，在干扰株系中显著下调，且其表达受白粉菌诱导显著增强。功能验证表明，瞬时过表达VqDSC1（OE-VqDSC1）可诱导超敏反应（HR）并增强葡萄白粉病抗性，而干扰株系（RNAi-VqDSC1）则表现出感病表型。
图5. 使用DNA亲和纯化和测序（DAP Seq）技术检测VqWRKY46在全基因组范围内的结合序列和靶基因。
综上，该研究揭示VqWRKY46与VqNF-YC9通过形成同源二聚体及蛋白复合体的双重机制，协同调控VqDSC1的表达，进而介导葡萄白粉病抗性。研究最终阐明了VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1信号模块的抗病调控网络，为葡萄抗病分子育种提供了关键基因靶点及理论支撑。
图6. VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1正向调控葡萄白粉病抗性模型。